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qjwqvbvb_009新虫 (初入文坛)
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PCR反应体系中各离子成分的作用分别是什么？ 已有2人参与
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| PCR反应体系中，betaine 起什么作用？钠离子、镁离子、氨根离子、硫酸根离子、CL离子、钾离子、TRIS粉以及其他表面活性剂，它们的作用分别是什么？请详细点回答，多谢！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 楼主没问到的问题都回答了，呵呵~对新手很有帮助。 2011-08-10 17:51:50
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 楼主没问到的问题都回答了，呵呵~对新手很有帮助。 2011-08-10 17:51:50
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PCR反应的成分和作用 总体积：一般为25μl～100μl 一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。、 三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。 四、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 五、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 六、模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 七、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 |
3楼2011-08-10 12:16:10
jinkui960
至尊木虫 (知名作家)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-08-10 12:14:03
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-08-10 12:14:03
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PCR反应体系其实就是一个酶催化系统，缓冲液中的Tris就是维持PH稳定的作用，为酶催化提供稳定的PH条件，促进PCR反应的顺利进行，而镁离子的存在与否至关重要，氨根离子、硫酸根离子的CL离子作用不大。 10×buffer和Taq酶储存缓冲液的组成如下： 反应缓冲液[10×]含：100 mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃), 15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2, 0.01%(W/V)明胶。 酶储存缓冲液含：50%甘油，100mmol/l KCl, 20mmol/L Tris-HCl ph8.0， 1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT， 200μg/ml明胶， 0.5%吐温20，0.5% Nonidet P40 缓冲液中镁离子浓度可直接关系DNA聚合酶的活性和DNA双链的解链温度，因此对反应的特异性及产物有显著影响。镁离子浓度过低会使DNA聚合酶活性降低、PCR产物下降;镁离子浓度过高则影响PCR反应的特异性。钱离子的最佳作用浓度为1.5一2.0mmol/L。 EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg2+结合而降低Mg2+有效浓度。 KCl浓度，K+浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。 明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR结果，影响不大。 [ Last edited by jinkui960 on 2011-8-10 at 10:30 ] |
2楼2011-08-10 10:29:31
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