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lwj6000

木虫 (小有名气)

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[交流] 分子生物学技术综合实验讲义1(上海交大)

实验一  大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．小型高速离心机
2．恒温摇床
3．恒温箱
4．-20℃冰箱
5．恒温水浴器
(二)材料
1．氨苄青霉素
2．大肠杆菌DH5
3．pUC19
4．1.5mL 离心管
5．枪头、枪
6．试管、培养皿
(三)试剂
1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）
2．LB培养液
   在950mL去离子水中加入：
   胰蛋白胨 (tryptone)                10g
   酵母提取物 (yeast extract)             5g
   NaCl                            10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。

[实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50L菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500L。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化：
1．新鲜制备的或-20℃下保存的100L感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．加入5L pUC19质粒，DNA浓度为10pg/L，轻轻混匀。
3．冰上放置30分钟。
4．42℃水浴热激60秒。
5．冰上放置2分钟。
6．加400L LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。
7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400L上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
8．将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。
9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。

[实验结果]
经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每g 质粒DNA 转化的菌落数表示。

实验二  质粒DNA的提取

[实验原理]
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温培养箱
2．恒温摇床
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
(二)材料
1．带有pQE-31质粒和pUC18-CAT质粒的两株大肠杆菌
2．1.5mL 离心管
3．枪头、枪
(三)试剂
   质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

试剂盒的参考配方:
Solution I
      50mmo1／L  葡萄糖
      5mmo1／L  三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris•HCl(pH8.0)
      1.0 mmo1／L  乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
Solution II
      0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合
Solution III
      5mo1／L 醋酸钾  60  mL
      冰乙酸       11.5mL
      水             28.5mL
TE缓冲液
      10mmo1／L Tris•HCl
      1mmo1／L EDTA(pH8.0)
胰RNA酶(RNA酶A)
将RNA酶溶于10mmo1／L Tris•HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

[实验步骤]
  (一)提取质粒
将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE-31质粒和pUC18-CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)
  (二)质粒的琼脂糖凝胶电泳
将5L洗脱液与3L的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。

附：试剂盒说明书

  3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1
上海申能博彩生物科技有限公司
bbst＠shl63．net  www．biocolors.com

试剂盒组成：

组成    K1910（50次）    K1920（100次）       K1930（250次）
   Solution I(a)       5m1       10m1       25m1
   Solution II(b)       10m1       20m1       50ml
   Solution lll       20m1       50m1       2x50m1
   Wash Solution (c)       22m1       2x22m1       5x22m1
   TE(d)       5m1       10m1       40m1
   3S Column       50支       100支       250支
   Co11ection tube       50支       100支       250根
   说明书       1份       1份       l份

注：
a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。
b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。
c)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。
  主要特点：
  ●  采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。
  ●  经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。
  ●  无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。
  ●  质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。

实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)

1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。
2．加入100l solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；
质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200l Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4．加入400l Solution III，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。无需低温离心。
注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700l Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50l TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30l预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞，质粒如果用50l水洗脱，通常情况下可以取10l洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。



实验三  DNA的琼脂糖凝胶电泳

[实验原理]
DNA分子在高于等电点的pH  溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]
  (一)仪器
1．恒温培养箱
2．琼脂糖凝胶电泳系统
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
5．紫外核酸检测仪
  (二)材料
1．pQE-31和pUC18-CAT质粒
  (三)试剂
1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)
   配1000mL 50xTAE：
   Tris          242  g
   冰醋酸          57  mL
   0.5mol／L EDTA  200  mL
   pH 8.0
2．凝胶加样缓冲液(6x)
   溴酚蓝    0.25％
   蔗糖          40％
3．琼脂糖
4．溴化乙锭溶液(EB)  0.5µg／mL
5．250bp DNA 分子量标准

[实验步骤]
(一)制备琼脂糖凝胶
根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度％    线性DNA的有效分离范围／kb
   0.3                      5—60
   0.6                      1—20
   O.7                   0.8—10
   O.9                   0.5—7
   1.2                   0.4—6
   1.5                   0.2—4
   2.0                   0.1—3

实验用1.2％琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。
(二)胶板的制备
1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。
2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。
5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。
(三)加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。  (四)电泳
1．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。
2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。
(五)染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。

[实验结果]
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)。

[ Last edited by lwj6000 on 2006-10-29 at 05:52 ]

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