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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

[交流] 活动【xxx的一天】---欢迎大家积极参与

×××的一天

【活动宗旨】：本次活动旨在鼓励大家分享实验过程中的心得体会，使得后来人能够注意到具体实验过程中一些小而重要的事项，少走弯路。
【活动发起人】: 生物版全体版主及专家顾问
【活动内容】：
生物总版所有成员都可以以“【活动】×××的一天”为主题发帖，字数不少于200字，所发主题帖将列入活动范围，并根据其详尽程度及广大虫友的好评获得金币奖励。最后，所有的主题帖将被结集刊出并分享给论坛所有虫友。
【活动规则】：
1) 所发主题帖必须是关于具体的某个生物实验过程，如蛋白纯化、Southern、Western、Chip，Microarray 等；
2) 帖子内容应尽可能详尽，步骤条理明确，括号中注明注意事项并做出合理解释；
3) 所有主题帖都将由虫友监督，谢绝粘贴复制，一经发现，将不被纳入活动范围；
4) 最终纳入结集的主题帖都将得到丰厚的金币奖励，具体数额待定。
【活动时间】： 2011-7-8至2011-8-31

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rainwander

wolfebst

xp198766

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1楼 2011-07-09 10:06:59

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winzhouyun

铜虫 (职业作家)

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贵宾: 0.544
金币: 53.2
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在线: 553.6小时
虫号: 996222

Elispot的一天
1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。
2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。
3. 3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul，盖上板盖，4℃过夜。
4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。
5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS，盖上板盖，室温下孵育2小时。
6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
7.用100ul PBS洗涤一次。
8.每孔加入100ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。
9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。
11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，37℃下孵育1小时30分。
13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，37℃孵育1小时。
15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。
18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。
　　此板在室温下避光保存。
使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的至癌物质，试验时带手套，使用后适当处理。

[ Last edited by winzhouyun on 2011-7-9 at 10:22 ]