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hongxing616

木虫 (小有名气)

[交流] WB实验疑问

做WB时用的上样缓冲液里面的β-巯基乙醇可以用什么替代？
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1楼 2011-04-21 19:07:02
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314300420

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hongxing616(金币+2): O(∩_∩)O谢谢！！ 2011-04-22 08:29:48
引用回帖:
Originally posted by hongxing616 at 2011-04-21 19:07:02:
做WB时用的上样缓冲液里面的β-巯基乙醇可以用什么替代？

DTT（二硫苏糖醇），用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键，价格相对比β-巯基乙醇高，但无特殊气味。
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2楼2011-04-21 23:19:26
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
hongxing616(金币+3): 十分感谢！！ 2011-04-22 08:30:18
引用回帖:
Originally posted by hongxing616 at 2011-04-21 19:07:02:
做WB时用的上样缓冲液里面的β-巯基乙醇可以用什么替代？

可以用二硫苏糖醇（DTT)、TCEP等代替β-巯基乙醇。
下面是google来的：
1. http://www.biodee.net/Article.aspx?id=194
DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高一些。

2.http://xiaowangzi1546.blog.163.c ... 025201072222510612/

还原剂是一类能使其他物质被还原或获得电子的物质。在使其他物质被还原（获得电子）的过程中，还原剂本身被氧化了，也就是说还原剂通过自身被氧化（失去电子）而使其他物质被还原。

二硫苏糖醇DTT，beta-巯基乙醇，TCEP等是巯基类还原剂。还原剂可以保护蛋白质上自由的巯基不被氧化，从而避免蛋白质的聚集或变性。在结晶实验中，一般使用的还原剂工作浓度是1 － 10 mM 。

beta-巯基乙醇是上述三种还原剂中还原能力最差的一个，因为它本身只有一个巯基。它的效果一般只能维持2－3天。因此，在实验中要每隔2－3天补加一次beta-巯基乙醇来维持它的作用。由于beta-巯基乙醇是挥发性的，因此，可以在池液中加入beta-巯基乙醇，利用它的挥发扩散到液滴中去。

二硫苏糖醇DTT有两个巯基基团，其作用能维持3－7天。DTT的挥发性不像beta-巯基乙醇那么强，所以使用时应该直接加入到悬滴中去。DTT还可以通过微透析的方法加入。

TCEP的还原能力比beta-巯基乙醇和DTT都强，它的作用可以维持2－3周。TCEP能使结晶用的缓冲液酸化。与DTT类似，TCEP需要直接加入到悬滴中，因此可以考虑微透析法。

beta-巯基乙醇，DTT，和TECP的作用机制可能不同。像其他添加剂一样，如果你发现一类物质对样品的稳定性和结晶有利，则可以去筛选这一类物质中最适合你的样品的一种。我们建议是，最好这三种还原剂都尝试一下，去发现最适合的。

有报道指出还原剂作为没有自由巯基的蛋白的添加剂的情况下长出了晶体的成功案例。

还原剂可以与金属离子结合，金属离子其被还原，而还原剂的作用被抑制。这就使得用重金属原子作同晶置换法遇到了麻烦。可以使用EDTA来避免还原剂被金属离子抑制。但是，如果金属离子是你的样品蛋白维持活性所必须的，就要小心使用EDTA了。
碱性条件下，beta-巯基乙醇和TECP更稳定，效果要好于DTT。酸性条件下，TCEP的稳定性也要好过DTT。
DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要避免使用DTT，而应该考虑beta-巯基乙醇和TECP。
半胱氨酸也是一种还原剂。在结晶实验中，半胱氨酸局限性很明显，那是由于它容易形成六角形的晶体。但是，半胱氨酸是一种有效的添加剂，能带来明显的效果，不过需要铭记它的局限性。
如果预期到蛋白会被氧化，从制备样品开始就要加入还原剂，并且在整个流程中要不断补加保证其效果。在悬滴法中，可以在池液里加入还原剂，利用还原剂的挥发扩散，保证悬滴中还原性的环境。
在确定还原剂和样品比例时，需要考虑样品上自由巯基的数目和样品浓度。自由巯基数目越多，样品浓度越高，还原剂的用量就越大。
含砷化合物与还原剂不能共用。 二甲胂和 二甲胂酸钠是结晶中常使用的含砷化合物，它们不能与还原剂共同使用。其他不能与还原剂一起使用的物质还包括：硝酸铵，过氧化氢，高氯酸钾，硝酸钠。在使用某种物质之前，应该先查阅Material Safety Data Sheet (MSDS) 。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-4-22 at 08:31 ]
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3楼2011-04-21 23:56:33
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