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RNAi的作用机制
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3 RNAi的作用机制 3.1 RNAi 的作用体现在两种水平上 ①转录水平。RNA 可以介导DNA 的甲基化(RNA-directed DNA methylation ,RdDM) 最早发现于一种植物的类病毒系统。dsRNA(double-strand RNA) 被降解成21～23 个核苷酸长的小片段RNA 时，这些小的RNA 分子在细胞核可以诱发同源序列的DNA 甲基化[5] 。这种序列特异性的甲基化的信号与RNA-DNA 结合有关[6 ] 。当dsRNA 含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。非致病病毒的造成转录水平基因沉默相关的RdDM最先发现于以菜花样花叶病毒，其35S 启动子转录得到含有胭脂碱合成酶启动子(NOSpro) 序列的NOSproRNA。在转基因烟草中，据报告未腺苷酸化的NOSpro dsRNA可以诱导同源NOSpro DNA 的甲基化，并使拷贝在转录水平上反式失活。在链胞霉属，DNA 的甲基化可能是异染色质的siRNA 介导的组蛋白H3 K9 的甲基化，是由H3 甲基转移酶催化的[7] 。 ②转录后水平。⑴特异切割dsRNA 的RNA 酶Ⅲ家族核酸酶Dicer 依赖ATP 切割dsRNA ，将其分解成具有2 个核苷酸的3′悬端(overhang) 的19～21b 小片段的双链siRNA。⑵RISC(RNA 诱导的沉默复合物RNA-induced silence complex) 识别并降解mRNA。RISC 是一种蛋白-RNA 效应器核酸酶复合物。双链siRNA 为RISC 的重要组分，它依赖ATP 解旋导致RISC活化，然后通过Waston-Crick 碱基配对识别底物mRNA 并与之结合，并自siRNA 的3′端将mRNA 切割成小于12nt 的片段使其降解[8 ] 。对一些人组织因子的试验表明，几个不同的siRNA 可以攻击同一个mRNA 的不同位点。只有一部分siRNA 会导致显著的基因沉默，这说明在人mRNA 上的siRNA 结合位点可能很少，且不活跃的siRNA 与活跃的siRNA 可逆性竞争[9 ]。 3.2 miRNA Dicer 酶产生两类功能特异的小分子RNA：siR2NA 和miRNA(micro-RNA)。Tuschl 等在从果蝇胚胎提取物的长的dsRNA 处理得到siRNA 的同时，得到了16 种20—23个核苷酸大小的短的单链RNA。这些RNA 由果蝇基因组编码并在0—2 周的胚胎内表达。它们具有潜在的调节基因表达的作用，被称为miRNA[10 ] 。miRNA 约21 个核苷酸大小，为单链结构，大多数miRNA 与底物mRNA 不完全配对结合，它们并不改变miRNA 的稳定性，而是通过抑制翻译来使基因沉默[11 ]，但目前至少发现一种植物miRNA(miR171) 与底物mRNA完全配对，这提示了miRNA 通过RNAi 途径调节基因表达的可能性[12] 。与siRNA 不同的是，由于miRNA 为单链结构，其作用不需要ATP 的存在。 3.3 RNAi 的放大效应 由于RNAi 的机制在生物体的效应极其显著，有研究提示，RNAi 通路应该有相应的放大步骤。放大效应可能的途径：①通过复制dsRNA 或者siRNA 进行。Nishikura 提出“过渡的RNAi (transitive RNAi) ”的机制，即由原先的靶序列的上游序列延伸形成新的siRNA，继续降解同源的基因家族成员或者切割mRNA[13 ] 。②多轮的RISC 效应。③RdRP(RNA 诱导的RNA 多聚酶) 的作用:植物和新秀丽小杆线虫的dsRNA 诱导的沉默都需要与RdRP 相似的蛋白质的参与[8 ] 。RNAi 一般在体细胞发挥作用，在ego21 表达的生殖细胞一种称为“随机降解PCR”的放大模型却提示RdRP 通过siRNA 引导链识别并结合mRNA，产生一种双链RNA 的Dicer酶底物，以产生更多的siRNA。 5 Mette MF ,Matzke AJ ,Matzke MA. Resistance of RNA-mediated TGS to HC2Pro ,a viral suppressor of PTGS , suggests alternative pathways fordsRNAprocessing .CurrBiol ,2001 ，11(14) :1119-1123. 6 Mette MF ,Aufsatz W,van der Winden J , et al . Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA . EMBO J ,2000 ,19(19) :519425201. 7 Tamaru H , Selker EU. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa . Nature ,2001 ,414 (6861) : 277-283. 8 Hannon GJ . RNA interference . Nature ,2002 ,418 (6894) :244-251. 9 Holen T ,Amarzguioui M,Wiiger MT , et al . Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor . Nucleic AcidsRes ,2002 ,30(8) ： 1757-1766. 10 Lagos2Quintana M, Rauhut R ,Lendeckel W, et al . Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science ,2001 ,294(5543) :853-858. 11 Zeng Y,Wagner EJ ,Cullen BR.Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells .MolCell ,2002 ,9(6) :1327-1333 12 Hutvagner G, Zamore PD. A microRNA in a multiple2turnover RNAi enzyme complex . Science ,2002 ,297 (5589) :2002-2003. 13 Nishikura K. A short primer on RNAi :RNA2directed RNA polymerase acts as a key catalyst.Cell ,2001 ,107 (4) :4152418. |
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