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基因工程技术的科普介绍(转载)
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基因 脱氧核糖核酸是于19世纪中叶发现的，当时孟德尔修道士进行了著名的豌豆培育实验，实验证实高度和颜色等物理特征可以经过后来称为基因的遗传单位从一代遗传给下一代。但是基因的物理特征却一直困扰着科学界，直到1944年纽约洛克菲勒研究所细菌学家奥斯瓦尔多·艾瑞（Oswald Avery）发现要把无害细菌转变成为导致肺炎的基因只需向无害细菌中导入导致肺炎的菌株即可。这些试验表明，基因是由脱氧核糖核酸构成，它使得许多研究者从此踏上寻求脱氧核糖核酸结构的漫长征途，以揭开基因对所有生物的影响之谜。 伦敦国王大学的罗萨林·福兰克林（Rosalind Franklin）和迈斯·维金（Maurice Wilkins）两位研究者研究了经X光拍照而呈现出的脱氧核糖核酸纤维的结构。照片清楚地显示脱氧核糖核酸是规则的螺旋形结构。随着人们对脱氧核糖核酸化学结构的知识和了解的增加，英国剑桥的医学研究协会试验室的詹姆斯·沃森（James Watson）和弗朗西斯·克瑞克（Francis Crick）开始建立脱氧核糖核酸分子模型以解释照片中出现的脱氧核糖核酸的分子结构。他们在1953年提出的脱氧核糖核酸分子模型是两股相互缠绕的双螺旋结构，两股之间由一系列横档连接。他们指出，每个横档都是由一对或两对碱基对构成--这些碱基对分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。这些年轻科学家还正确地推测说，脱氧核糖核酸双螺旋结构中的碱基对的排列顺序决定了每个生物的遗传特征。他们同时意识到，脱氧核糖核酸的双链结构可以分离进行复制--这是一种将遗传信息从一代传递到另一代的简单机制。 在沃森（Watson）和克瑞克（Crick）揭示脱氧核糖核酸结构后几年，许多其他研究者，尤其是全国卫生研究所的马绍尔·尼伦博戈（Marshall Nirenberg）和英属哥伦比亚大学的哈·格宾·克拉纳（Har Gobind Khorana）成功地破解了基因密码。所有生物细胞通过基因密码将其脱氧核酸中的碱基所包含的信息传递到成千上万个蛋白质，而蛋白质决定着细胞的结构及功能。这些信息包括决定眼睛颜色和患癌症可能性等基因特征。研究者发现每三个碱基对（例如CTG）代表着一个氨基酸的密码（如CGT代表亮氨酸）或代表着构成构成蛋白质的一长串氨基酸链结构信息。 基因芯片 基因芯片（gene chip, DNA chip）作为最早的生物芯片产生于九十年代初期，目前已经在功能基因组研究中获得广泛应用。 基因芯片是将大量不同的生物信息分子（如寡核苷酸、DNA或cDNA探针等）以高度密集的方式有序固定在固相支持物上而形成的微阵列。通过与标记样品的一次杂交操作就可以同时获得样品中成百上千个目的序列的有关序列、来源、含量等方面的信息。作为信息载体的基因芯片，向高密度乃至超高密度方向发展是显而易见的，但最终发展到什么水平主要取决于基因芯片的微制造技术和芯片信息的读取技术的发展水平。 目前，在基因芯片的微制造技术上，主要有两类技术：在位合成法和非在位合成法。 1、 在位合成法包括光诱导在位合成法、压电印刷在位合成法和分子印章在位合成法等，三种方法各有所长，详情可参阅有关文献[7-9]。从目前制造工艺上看，Affymetrix公司发展的光诱导在位合成法比较适合于工业化规模生产，但每生产一种基因芯片都需要制作一套昂贵的光刻掩膜，只有进行大批量生产，才有可能降低成本。后两种方法目前正处在研究阶段。由于合成反应的产率问题，目前在位合成法只适合于制作Oligo-Array。在位合成法的优点是方法适合于大规模生产，制作的芯片密度高、信息量大；不足是要求了解待测核酸序列信息，这在未知序列信息的核酸研究中还有相当困难。 2、非在位合成法包括直接喷点法、微珠阵列法、微电极法等。直接喷点法是采用由机械臂控制的针或微喷嘴通过接触或非接触（喷）方式直接将预先合成（或分离、纯化）好的核酸分子以一定模式有序分配在经化学处理的固相支持物上，然后通过干燥、紫外交联等操作使核酸分子固定在其上[10]。这种方法的最大优势是研究者可以将任何长度的序列已知或未知的核酸片段（寡核苷酸或cDNA、RNA等）以类似的相对简单的方法固定在固相支持物上。根据需要设计制作自己感兴趣的芯片的灵活方式，使直接喷点法在许多研究单位获得应用。所需设备较便宜、方法简单，尤其适合于小批量制备研究型芯片。 SNP 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。 理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C T，在其互补链上则为G A)，也可能是颠换(C A，G T，C G，A T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。 从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。 先形成的SNP在人群中常有更高的频率，后形成的SNP所占的比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相同，但大约有85%应是共通的。 SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究： 1、 SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP 遍布于整个人类基因组中，根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。 2、 SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。 3、 SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样本制作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得信号的比例确定混和样本中各种等位基因的频率。 4、 易于基因分型。SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：(1)鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术；(2)完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。(3)化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。 [ Last edited by gene121 on 2006-8-30 at 15:40 ] |
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PCR PCR(Polymerase Chain Reaction)是聚合酶链反应技术的英文缩写，是基因扩增技术的一次重大飞跃，该技术1985年由美国PE公司遗传部的Kary B Mullis教授发明。PCR技术首先应用于人β-珠蛋白DNA扩增及镰刀状红细胞贫血症的产前诊断。由于此项技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测到单分子或每10万个细胞中仅含1个靶DNA分的样品，因而，此技术在短短的几年内就广泛的应用于分子生物学、医学、微生物学、遗传学等领域。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶(如Tag酶等)的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步： ① 变性(denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。 ② 退火(annealling)：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补复性的机会较少。 ③ 延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷之磷酸底物及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制。决定PCR扩增特异性的引物是由人工合成的一段寡核苷酸。在反应的最初阶段，原来的DNA起着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介异延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5′末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5′端之间的DNA片段。 对于扩增产物的分析通常采用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，根据扩增产物的片段大小来判断扩增结果，也有其它分析扩增结果的方法。 有关PCR技术及其应用可参阅以下文献： ① 《聚合酶链反应》；(美)穆里斯(K B Mullis)等著，陈受宜等译。北京：科学出版社，1997； ② 丁振若、苏明权主编《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版西安公司，1998。 核酸杂交 核酸杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。经典的核酸杂交方法是将DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记，在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。 经典的核算杂交方法主要包括：DNA印迹杂交（Southern blot）RNA印迹杂交(Northern blot)以及斑点杂交和原位杂交： 1、 DNA印迹杂交（DNA blot hybridization）——有两种核酸印迹法： 将DNA或RNA溶液直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上（斑点或狭线印迹） 经琼脂糖凝胶电泳将片段的DNA或RNA转移到膜上（Southern和Northern印迹法）。DNA在电泳前先用限制性内切酶消化。 2、 RNA印迹杂交（RNA blot hybridization）： RNA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RNA或mRNA特定靶序列的技术。 3、 斑点杂交 将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏氟乙烯（PVDF）与DNA结合力更高，坚韧、易操作。点样可手工，也可用手工点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色。可用于DNA或RNA分析。 4、 原位杂交 在保持细胞形态条件下，进行细胞内杂交，显影或显色。可用于DNA或RNA分析。荧光原位杂交（FISH）进行染色体DNA分析可用于生物学研究的许多领域以及临床细胞遗传学研究。其主要优点是不仅可以在细胞分裂的中期，而且可在分裂间期核中诊断染色体的变化。 广义的核酸杂交就是指非同源的核酸分子间的复性（氢键结合）过程。因此可以说，目前的基因检测技术，除了质普法外都或多或少的涉及了核酸杂交原理。如PCR的引物复性过程、基因芯片的杂交检测过程、基因测序的引物复性过程以及各种SNP检测方法等等。 生物芯片 生物芯片是基于大规模平行处理生物信息分子原理的微型装置，具有信息通量大、自动化、系统化的特点。作为交叉学科研究前沿，其发展不仅有利于产生新的学科增长点，推动自然科学的整体进步，而且有利于开辟新的高科技产业机会。因此，生物芯片产生之初，就不仅受到科学界的普遍重视，而且也受到新闻媒体、政治家甚至公众的广泛关注，发展十分迅速。目前已发展为一大家族。 根据用途可将生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。其中信息生物芯片是将生物信息分子（如核酸、蛋白质等）高密度地固定在固相支持物上，通过与样品中目的分子的作用获取生物信息。由于信息生物芯片是以获取生物信息为目的，因此其发展方向必然是高密度。以DNA芯片为例，目前密度已达106dot/cm2 。功能生物芯片是指由多种微流体管道、腔体按一定的方式连接而成的满足一定功能要求的微装置。由于功能生物芯片是以完成某种功能为目的，因此其发展方向必然是高复杂程度的集成化。目前已经在名片大小的芯片上实现了DNA分子的提取、纯化、扩增、标记、杂交检测等功能的一体化集成。 生物芯片正处在快速上升的发展时期，目前已经在后基因组计划研究、生物医学研究、新药筛选等领域中获得广泛应用。由于其具有的重要科学意义和产业价值，世界上著名的大公司如PE, Motorola,Agilen等以及一些著名的风险投资纷纷介入，为生物芯片的发展和市场化起了推波助澜的作用。国内目前虽然从事生物芯片研究的单位已有不少，但大多是重复国外的研究思路，缺乏创新性。此外由于有限的资源多被用于重复建设，研究的后劲不足。如何在把握生物芯片发展方向的同时，合理配置资源，在创新性上多做文章，应是目前的当务之急。 |
2楼2006-08-30 11:37:39
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基因测序 人的基因组中含有32亿个碱基，面对近乎天文数字的碱基，如何得到确切的序列？"很简单，"研究人员说，"就像搬运组合家具可以先拆散再组装，基因也是先'分段'、'测序'，再拼接的。" 以家猪基因组为例，10亿个碱基就像一个组合大橱，在超声波的作用下，被打碎成无数个DNA片断，就像组合大橱被拆散成抽屉、门板。研究人员拿出一个含有96孔的塑料小盒，告诉记者：这些小孔里就装着被超声波击碎后的DNA片段，经过特殊处理后以备检测。 测序实验房里，38台最先进的测序仪正嗡嗡作响。每台测序仪上都有一个电脑屏，屏幕上排列着许多五颜六色的小方块，煞是好看。仔细端详，发现一共只有红黑蓝绿四种颜色。研究人员说，这分别代表四种碱基。DNA片断如何变成可以识别的碱基？研究人员介绍，在测序仪内，每个DNA片段都快速通过一根内径只有75微米的毛细管，通过时接受激光照射，测序仪就能够自动识别每个DNA片段所代表的碱基序列。如此大量反复实验，最终获得一段段碱基链。"这过程，就好像是一群人排队照Ｘ光，"研究人员介绍，"最后得到大量的Ｘ光照片。" 目前，这种最先进的测序仪日测序能力达到50万个碱基，比中国参加"1％任务"的测序仪速度要快近5倍！据研究人员介绍，这样的仪器在北京基地还有32台。 测序仪测出的仅是一段段碱基链，还需连接成一条完整的基因图谱，而这种相当于"拼装组合家具"的工作，竟是由中国目前运算速度最快的曙光3000超级计算机完成的。这位"神算子"有一人多高，乍一看，仿佛是五六个大型立式空调并排在了一起。华大基因南方基地生物信息学部部长曹凡介绍，这台计算机运算速度每秒4032亿次，2月份刚通过鉴定，国内一共3台，其中两台落户华大基因中心，一台在北京，一台在杭州。如果比喻它的运算能力，大概相当于500台最新奔腾Ⅳ1G电脑的累加速度。"每天测序仪提供的200多亿个数据通过分析后拼接，"曹凡说，"最后形成一条完整的基因图谱。"记者看到，所谓的基因图谱，其实是一个枯燥的大型数据库，但曹凡说，它们正是生命最基本的密码。 基因克隆 基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。 基因克隆技术包括一系列技术，大约建立于上世纪70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。 一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。单就"克隆"一词而言，可以指克隆技术，但通常指一单一分子或细胞的大量的完全相同的后代。对基因来说，某个基因的大量完全相同的后代即为该基因的克隆。在转基因植物技术中，对分离出来的有用基因，进行大量克隆，然后利用这些基因克隆，进入下一步的操作。 基因治疗 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，目前开展的基因治疗只限于体细胞。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。 广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，而通常说的狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列，主要的治疗途径是体外（ex vivo）基因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。除间接体内法外，还可以用基因药物进行直接体内途径治疗，这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段（包括DNA或RNA）；可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗（包括DNA转录水平和mRNA翻译水平）。基因药物不但可用于治疗疾病，而且可用于预防疾病。这类基因药物治法简单易行，发展迅速，新型基因药物不断产生。从1990年转移ADA基因到现在的大部分基因治疗临床试验都是体外基因治疗，先从病人体内获得某种细胞（例如T淋巴细胞），进行培养，在体外完成基因转移后，筛选成功转移的细胞扩增培养，然后重新输入患者体内。这种方法虽然操作复杂，但效果较为可靠，称其为。同时，科学家们又千方百计设计出更加简便的基因治疗方法。例如，1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。这种直接往人体组织细胞中转移基因的治病方法叫做体内（in vivo）基因治疗。 外源基因只有整合到染色体中，变为其中一部分才有可能得到持续的高表达。因此，采用什么样的手段将精心挑选的功能基因送到体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是基因治疗成败的关键。无论是体内（in vivo） 还是体外（ex vivo）基因转移都需要一种安全、无毒的工具来携带外源基因进入细胞内，这种工具被称作载体（vector）。科学家们发现，病毒侵染人体细胞时能将自身的基因组携带到细胞内，并利用人体细胞内物质完成自身繁殖，最终导致人类疾病。利用这一特性，科学家将病毒基因组中与致病相关的基因去掉，保留其携带基因组进入人体细胞的功能，再组装上理想的外源基因，即成为一种病毒载体。这样经过遗传修饰的病毒载体不能在人体细胞内复制，更不会致病，只可能将外源治病基因带入人体细胞内。目前，世界各国对病毒载体的研究较广泛，绝大多数临床试验都运用了这种方法。 基因诊断 运用基因分析对疾病作出诊断的方法。传统诊断方法是通过表现型来推测基因型，而基因诊断是从基因着手来推断表现型，即绕过基因产物，通过直接探查基因进行诊断，不受细胞类型和发病年龄的限制，可用于一切遗传病和感染性疾病的诊断。其主要方法有： ① 斑点杂交法：将待测DNA加热使双链成为单链，然后点加在硝酸纤维素滤膜上，再加入标记探针作杂交试验以判断受检基因的有无和数量。此法可用于探测外源基因（肠道病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒、爱滋病等有关病毒的DNA）和恶性疟原虫、锥虫的DNA。 ② DNA杂交吸印法：将待测DNA以特定的限制性核酸内切酶消化后形成许多长度不等的片段，经电泳分离加热后吸印到硝酸纤维素滤膜上，再与标记探针杂交，以判断基因的改变状况。人工合成寡核苷酸探针可直接进行探测。 ③ 此外，还有PCR法，PCR-RFLP法，基因芯片法等等。 基因诊断已用于镰刀状红细胞贫血症和地中海贫血症的诊断；对肠道病毒、疱疹病毒、腺病毒、肝炎病毒等引起的疾病，基因诊断技术已用于临床实践。 |
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