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rb木虫 (著名写手)
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【转载】分享《转染技术要点及转染试剂的选择》【已搜无重复】
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[watermark]转染技术要点及转染试剂的选择 转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择。 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-96小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染效率收多种因素影响，主要因素有下面几个： 1. 细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前24小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。 2. 血清 大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右) 试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。 3. 载体构建 转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。 4. DNA质量 DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍2x CsCl梯度离心以上的纯度效果，使您不必为DNA质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。 5.转染技术 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下： 转染方法 原理 应用 特点 DEAE-右旋糖苷法 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时性转染 相对简便、结果可重复 但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清 磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用 电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件 阳离子性的脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广，转染效率高， 重复性好但转染时需除血清 转染效果随细胞类型变化大 病毒介导法 逆转录病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 特定宿主细胞 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等 但携带基因不能太大 细胞需处分裂期 需考虑安全因素 腺病毒 瞬时转染 特定宿主细胞 可用于难转染的细胞 需考虑安全因素 Biolistic 颗粒传递法 将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达 瞬时性转染 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞 显微注射法 用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 稳定转染 瞬时性转染 转染细胞数有限 多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 Plasmid Purification Methods vs.Transfection Efficiency 图1. Primary rabbit gastric parietal cells were transfected with a GFP reporter plasmid prepared using the methods indicated. Transfections were performed using Effectene Reagent or a commonly used liposome reagent (Liposome C). The bars represent the percentage of total cells expressing GFP as determined by scoring the number of green fluorescent cells 48 h post-transfection. Data represent the average of 6–9 replicate dishes using more than 2 different DNA preparations for each purification method. Data kindly provided by J. Parente and C. Chew, Institute of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, GA, USA. Plasmid Purity and Quantity vs.Transfection Efficiency 图2.Effect of the amount and quality of DNA (a luciferase reporter plasmid) on transfection efficiency in CHO SSF variants grown in suspension under serum-free conditions. Each point represents the mean of three independent experiments; bars represent standard deviations; Rel. LU: relative light units. Data kindly provided by M. O. Zang-Gandor, Novartis AG, Basel, Switzerland. 除上述传统方法外，德国QIAGEN公司近年推出了几种革新的技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。具体地分以下几种： 1. 活性dendrimers：Superfect Transfection Reagent Dendrimers 是一个高度分枝的球形分子，分枝从球心放射状发出，终止于带电荷的氨基集团。由于它是化学合成的，有精确的大小和形状，保证一致的转染复合物形成和转染的重复性。部分地活性改造使它具有更高的弹性（见图1）同样，用它转染时也不用除血清，对细胞毒性小，转染效率高。 Schematic diagram of an activated and non-activated dendrimer. A portion of the activated dendrimer molecule is enlarged to show the chemical structure of the molecular branches. 图3 Dendrimers结构示意图 2. 专门为常用细胞优化的―Polyfect Transfection Reagent QIAGEN还专门为实验室常用细胞：COS-7，NIH/3T3，HeLa，293，CHO优化设计了基于活性dendrimers技术的Polyfect transfection reagent，操作更加简便，而且价格经济。 3. 改良的脂类转染试剂―Effectene transfection reagent 除了在脂类的结构上有所改进外，它还增添了增强分子（Enhancer molecular）将DNA浓缩后与转染试剂反应（见图2），不仅转染效率高，还大大节省了DNA用量（只需一般脂质体的1/5）。此外，与一般脂质体相比，它在转染时无需除血清，既简化了操作，更提高了对血清敏感的原代细胞等的转染效率。（见图３ａ和ｂ操作流程比较）。 图3.A Liposome-Mediated Transfection 图3.B Effectene procedure 4. 最新转RNA的―Transmessenger transfection reagent RNA转染不依赖启动子，无需转录直接表达功能蛋白，是不同于DNA转染的另一种思路，尤其对质粒DNA转染困难的情况下更是一个好方法。此外RNA转染还可以用作RNA病毒，RNA翻译研究及RNA干扰（RNAi）实验。基于改良脂类技术的转染试剂Transmessenger transfection reagent是最新推出的专门适用于转各种RNA的转染试剂，配有浓缩RNA的增强分子，无RNA酶污染，操作方便，转染效率高。（见流程图图４及转染效果图图５） 此外，QIAGEN网www.QIAGEN.com/transfectiontools提供它的所有转染试剂的适用细胞株及发表文献的在线查询，以便广大用户更快更有效地选择合适的转染试剂及设计转染实验。我们将继续追踪这方面的新技术及应用尽快提供给大家。 图5 Western blots of transfected HeLa-S3 cell extracts using lamin A/C- or vimentin-specific monoclonal antibodies. Cells were transfected using the indicated reagents. TM: TransMessenger Transfection Reagent; siRNA; short interfering RNA; ODN: scrambled 24mer oligodeoxynucleotide. A Lamin A/C expression was significantly reduced in cells that had been transfected with TransMessenger Reagent-siRNA complexes. B Expression was not suppressed in cells that were untransfected, transfected using TransMessenger Reagent or siRNA alone, or transfected with a scrambled ODN–TransMessenger Reagent complex.[/watermark] [ Last edited by zhoukoulk on 2008-11-24 at 14:49 ] |
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