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ballackmakay

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[交流] 免疫球蛋白提取技术

免疫球蛋白提取技术
免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步代表着B细胞的功能，因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。
随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

一、 IgG的分离与提纯

（一）材料与试剂配制
1．动物血清
2．硫酸铵饱和溶液
硫酸铵          800g~850g
H2O             1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O       15.60g
加H2O至          1 000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•12H2O       35.80g
加H2O至             1 000ml
取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4．1％BaCl2溶液
5．纳氏液
HgI          115.00g
KI          80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃纸）。
（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。
2．3 000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3．在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30ml，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30min。
4．3 000r/min离心20min，弃上清。
5．于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，静置30min。
6． 3 000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。
7．用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。
8．透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。
以1％BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+（取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4+存在），直至无 SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9．离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11．蛋白质及其定量鉴定（见本章第八节）。
12．IgG的纯度鉴定  可采用下列方法之一鉴定。
⑴ 区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。
⑵ 琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
⑶ 免疫电泳鉴定：（操作见第三章免疫电泳部分）。孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。
⑷ 圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。
13．IgG的浓缩与保存
⑴ IgG的浓缩：参看本章第九节。
⑵ IgG的保存：一般浓缩至1％以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。
（三）IgG的简易快速提取法
应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取IgG时，则往往采取下列的简易办法。
1． DEAE-纤维素直接提取法
取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。
⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液，静置30min，去上清细粒，再重复一次。
⑵用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤。
⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。
⑷于4℃中放置1h，中间搅拌数次。
⑸用布氏漏斗抽滤，再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素，抽滤。滤液即为提取的IgG液。
2．DEAE－SephadexA－50为弱碱性阴离子交换剂，经NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ－G。这种提取法流程大大缩短，纯化前后样品体积变化不大，而且所得γ－G无变性现象。经过四次处理，其纯度也较好。缺点是收集量少，损耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE－SephadexA－50若干克，悬浮于蒸馏水中，1h后倾去上层小颗粒，然后用0.50Mol/L NaOH处理1h，蒸馏水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液体体积1/4的滤干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不时搅拌、抽滤、收集滤液。
⑶ 再用同样重量的DEAE－SephadexA－50处理滤液。反复处理三次。（全程共四次）。获得滤液即为γ－G制品。
⑷ DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱，抽滤至滤液中无蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。
（四）禽血清IgG的分离与提纯（Na2SO4法）
1．试剂
⑴ 5％葡聚糖硫酸盐
⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液
⑶ 无水硫酸钠
⑷ pH8.2硼酸盐缓冲液
⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液
2．操作方法
⑴ 取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。
⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3 000r/min离心去上清。
⑶ 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。
⑷ 重复步骤⑶，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。
⑹ 过SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。
⑺ 如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。
也可以按以下操作方法进行：
⑴ 以18％硫酸钠（W/V）提取一次，再以14％的硫酸钠提取一次。
⑵ 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5％加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO42-为止。
⑶ 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
⑷ 过SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。

二、IgM的分离与提纯

（一）材料
1．血清
2．葡聚糖凝胶G200
3．洗脱液0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris－HCl+0.14Mol/L NaCl）。
（二）操作方法
选取2.50cm×90cm层析柱，用葡聚糖凝胶G200装柱，平衡后，直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品，洗脱液洗脱，流速0.25ml/min，分管收集，测OD280值，第一峰即为IgM。将第一峰的数管混合，浓缩、鉴定。

二、 IgA的分离与提纯

（一）材料与试剂配制
1．DEAE52纤维素
2．0.10Mol/L ZnSO4液
ZnSO4•7H2O       2.88g
加水至1 000.00ml
3．饱和硫酸铵溶液
4．10％EDTA—Na
5．SephadexG200
6．0.01Mol/L pH7.4PB液
7．0.10Mol/L pH6.4PB液
8．血清
（二）操作方法
1．取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液，调pH至7.0，室温搅拌1h，离心去沉淀。
2．于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置30min或冰箱过夜。
3．10 000r/min离心10min，去上清。
4．取沉淀溶于4ml10％EDTA－Na溶液中。
5．生理盐水中透析除盐。
6．过DE52柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白（IgG）弃去。
7．换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱，收集蛋白峰，即为IgA。
8．再过SephadexG200柱，洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl），收集洗脱液测OD280值，取第一峰即为纯化IgA。
9．透析、浓缩、鉴定。

四、分泌型IgA的分离与鉴定

（一）材料与试剂
1．初乳
2．SephadexG200
3．0.10Mol/L pH6.8PB液
4．0.01Mol/L pH7.4PB液
5．DEAE52
（二）操作方法
1．取初乳20ml，10 000rpm离心10min，弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。
2．取乳清过SephadexG200柱（柱规格为2.50cm×90cm），以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱，第一峰为IgA（含IgG）。
3．收集乳液，于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
4．将透析液浓缩至5mg/ml以上。
5．过DE52层析柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱，洗下蛋白峰为IgG，弃去。
6．换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS（0.10Mol/L NaCl）液洗脱，
收集洗脱液，即为较纯的IgA液。
7．必要时，可再过一次SephadexG200柱。
8．浓缩，鉴定

五、禽IgA提取与纯化

（一）材料与试剂配制
1．禽胆汁
2．饱和硫酸铵溶液
3．0.01Mol/L pH7.4PBS液
4．0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）
5． DEAE52-纤维素
（二）操作方法
1．取冷藏的胆汁3Ⅹml，缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25％饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
2． 3 000r/min离心30min，去沉淀。
3．取上清，加饱和硫酸铵液，使成35％的饱和度，4℃放置30min。
4． 3 000r/min离心30min，弃上清。
5．取沉淀，加0.85％NaCl液溶解，加饱和硫酸铵溶液，重复步骤3和4三次。
6．将沉淀用0.85％NaCl液溶解，装入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7．以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，过DEAE52纤维柱（20×250mm）。
8．取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
9．再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl浓度为0.30Mol/L）洗脱，收集洗脱液。
10．浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml，分装，低温冰箱保存。

六、 IgE的分离与提纯

（一）材料与试剂
1．血清
2．饱和硫酸铵溶液
3．洗脱液0.005Mol/L pH7.4PB液
0.025 Mol/L pH7.4PB液
0.01Mol/L pH7.4PBS液(0.14mol/L NaCl)
4．DE52
5．SephadexG150
（二）操作方法
1．取血清倍比稀释后，加等量饱和（NH4）2SO4溶液，盐析。
2．离心取沉淀，溶于少量生理盐水中，透析、除盐。
3．过DE52柱，以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脱，收集洗脱蛋白峰(IgG)，弃去。
4．换以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗下的蛋白峰主要是IgE。
5．透析除盐。
6．过G150柱，以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl)洗脱，收集洗脱液即为纯化的IgE。
7．浓缩、鉴定。

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