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分子生物学实验常用试剂配置
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一. 常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性， 须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇 至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.1g的Na2EDTA•2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。 25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。 1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2•6H2O于足量的水中，定容到100ml。 100mmol/L PMSF：溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹 或贮存于-20℃。 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－free RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套） 5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。 10N氢氧化钠（NaOH）：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。 10％SDS（十二烷基硫酸钠）：称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L。 2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。 100％三氯乙酸（TCA）:在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。（稀释液应在临用前配制） 2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。 100×Denhardt试剂（Denhardt’s regent） 成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 2%聚蔗糖（Ficoll，400型） 2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40） 2%BSA（组分V） 水 2g 2g 2g 加水至总体积为100ml ,依照上表称取各组分，溶于水中定容。过滤除菌及杂质，分装成小份于-20℃贮存。 10×标准DNA连接酶缓冲液（standard DNA ligase buffer）（粘端、平端连接） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分的用量 0.5mol/L Tris-HCl:5ml1mol/L 贮液 ,100mmol/L MgCl2:1ml 1mol/L 贮液,100mmol/L DTT:1ml 1mol/L 贮液,2mmol/L ATP: 200ul 100 mmol/L 贮液,5mmol/L 盐酸亚精胺（可选）:50ul 1 mmol/L 贮液,0.5mg/ml BSA（组分V）（可选）:0.5ml 10 mg/mL 贮液 ,水: 2.25ml 将配制好的缓冲液分装成小份，贮存于-20℃ 。 100 mmol/L dNTP 溶液（dNTP solutions） 可以购买到100mmol/L纯dNTPs贮液，-80℃可贮存至少6个月。 10mmol/L dNTP混合液 成分及终浓度 配制20ul溶液各成分的用量 10mmol/L dATP 10mmol/L dCTP 10mmol/L dGTP 10mmol/L dTTP 水 2ul 100 mmol/L dATP 贮液 2ul 100 mmol/L dCTP 贮液 2ul 100 mmol/L dGTP 贮液 2ul 100 mmol/L dTTP 贮液 12ul 20％PEG 8000/2.5M NaCl 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分的用量 质量浓度为20％聚乙二醇 2.5mol/L 氯化钠 水 20g 50ml 5 mol/L 氯化钠 或 14.6g 固体氯化钠 补足100ml 加聚乙二醇于含有氯化钠的烧杯中，加水至终体积100ml，用磁力搅拌器搅拌溶解。 20×SSC 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 300mmol/L 柠檬酸三钠（二水） 3mol/L 氯化钠 水 88.2g 175.3g 补足1L 溶解柠檬酸三钠（二水）和氯化钠于约0.9L水中，加几滴10N NaOH溶液调pH为7.0，用水补足体积至1L。 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水 加100ul DEPC 于 100ml 水中，使DEPC的体积分数为0.1％。在37℃温浴至少12h，然后在15 psi 条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。DEPC会与胺起反应，不可用DEPC处理Tris缓冲液。 甲酰胺（deionized formamide） 直接购买或加Dowex XG8 混合树脂于装有甲酰胺的玻璃烧杯中，用磁力搅拌器轻轻搅拌1h，可去除甲酰胺中的离子。经Whatman 1号滤纸过滤除去树脂后分成小份，充氮气于-80℃贮存（防止氧化）。 磷酸缓冲液（phosphate buffer） 按照下表所给定的体积，混合1 mol/L 的磷酸二氢钠（单碱）和1mol/L 磷酸氢二钠（双碱）贮液，获得所需pH的磷酸缓冲液。配制1 mol/L 的磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）贮液：溶解138g于足量水中，使终体积为1L;1mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液:溶解142g于足量水中使终体积为1L。 1mol/L 磷酸二氢钠（ml） 1mol/L 磷酸氢二钠（ml） 最终pH值 TE（用于悬浮和贮存DNA） 成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 10mmol/L Tris－HCl 1mmol/L EDTA 水 1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25℃） 200ul 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 98.8ml Tris缓冲液（Tris-HCl buffer） 将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。 浓盐酸的体积（ml） pH |
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二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液 电泳缓冲液 50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 2mol/L Tris碱 1mol/L 乙酸 100 mmol/L EDTA 水 242g 57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L） 200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L 5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 445 mmol/L 硼酸盐 10 mmol/L EDTA 水 54g 27.5g 硼酸 20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L 染料 1％溴酚蓝（bromophenol blue） 加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。 1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF） 溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。 10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide） 小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。 凝胶上样液（gel loading solutions） 6×碱性凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.3 N 氢氧化钠 6 mmol/L EDTA 18％聚蔗糖（400型） 0.15％溴甲酚绿 0.25％二甲苯青FF 水 300ul 10N 氢氧化钠 120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.8g 15mg 25mg 补足到10ml 6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 15％聚蔗糖（400型） 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.5g 补足到10ml 6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（400型） 水 2.5ml 1％溴酚蓝 2.5ml 1％二甲苯青FF 1.5g 补足到10ml 6×甘油凝胶上样液（4℃贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 50％甘油 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 3ml 3.9ml 6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 40％聚蔗糖 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 4g 补足到10ml 10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.2％溴酚蓝 0.2％二甲苯青FF 200 mmol/L EDTA 0.1％SDS 50％甘油 水 20mg 20mg 4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100ul 10％ SDS 5ml 补足到10ml |
2楼2006-08-22 14:08:36
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三.常用培养基 LB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。 SOB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 5g 氯化钠 0.5g 1 mol/L 氯化钾 2.5ml 用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。 SOC培养基 成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。 TB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 12g 酵母提取物 24g 甘油 4ml 各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。 2×YT培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 16g 酵母提取物 10g 氯化钠 4ml 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。 YPD培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g 用水补足体积为1L后，高压灭菌。建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g色氨酸，因为YPD培养基是色氨酸限制型培养基。为了配制平板，需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。 四.常用抗生素 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml） 溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 几种溶液的配制方法 1、PBS: 取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。 2、TBS： 2.1 Tris缓冲液配方：（0.5 M pH7.6） Tris（三羟甲基氨基甲烷） 60.57g 1N HCL 约420ml 双蒸水 加至1000ml Tris缓冲液配制方法：先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）将pH调至7.6， 最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。 2.2 TBS配方： Tris-HCI缓冲液（0.5M pH7.6） 100ml NaCI 8.5~9g (0.15mol/L) 双蒸水 加至1000ml TBS配制方法：先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。 3、柠檬酸盐缓冲液（Citrate buffer）： 3.1 储存液： A. 0.1M柠檬酸溶液：称取21.01g柠檬酸（C6H8O7•H20）溶于1000ml蒸馏水中。 B. 0.1M柠檬酸钠溶液：称取29.41g柠檬酸钠（C6H5Na3O7•2H20）溶于1000ml蒸馏水中。 3.2 工作液： 取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6.00.1 4、胰酶（Trypsin）： 4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液： 常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合（1:3稀释），则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1稀释）。 4.2 ZLI-9010胰蛋白酶： 取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。 5、胃酶（Pepsin）： 4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。 （我公司备有ZLI-9013胃蛋白酶消化工作液，不需稀释直接滴加使用，欢迎选购） 6、DAB： 6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit： 使用前只需将试剂盒提供的A、B、C三种试剂各一滴加至1ml双蒸水中，即可获得1ml DAB工作液，简单易用。 6.1 ZLI-9030 DAB： 6mgDAB溶于10mlTBS（0.05M pH7.6），再加入0.1ml浓度为3％的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。 7、AEC： 4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液（pH5.2），然后加入0.15ml 3%H2O2，过滤掉沉淀物。 8、RIPA： 1×PBS，1%NP 40，0.5 sodium deoxycholate，0.1% SDS（此液体可长期保存）。以下抑制剂以储存液方式保存，临用前加入RIPA中。 8.1 10mg/ml PMSF异丙醇溶液（用量为10l/ml） 8.2 Aprotinin（Sigma产品，用量为30l/ml） 8.3 1000mM sodium orthovanadate冷冻液 （用量为10l/ml） 9、Blotto A： 常规使用1×PBS，5% milk，0.05% Tween 20。 10、Blotto B： 与Phosphotyrosine抗体共用，1×PBS，1% milk，0.05% Tween 20。部分实验中milk可完全去除，但可能引起背景增高。 |
3楼2006-08-22 14:09:03
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4楼2006-08-23 08:48:24
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