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喜洋洋1024

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[交流] 【求助】Sephadex LH-20溶胀用什么溶剂

如题使用前Sephadex LH-20溶胀用什么溶剂

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1楼2011-03-14 13:02:46

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ly_tryh

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喜洋洋1024(金币+1):谢谢参与

以前就用甲醇了

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2楼2011-03-14 13:29:11

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喜洋洋1024

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引用回帖:

Originally posted by ly_tryh at 2011-03-14 13:29:11:
以前就用甲醇了

用甲醇溶胀了之后再还要用洗脱剂清洗上样是这样吗

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3楼2011-03-14 13:37:37

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lengxin

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xiaodu2007693(金币+2): 谢谢 2011-07-10 14:06:44

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Originally posted by 喜洋洋1024 at 2011-03-14 13:37:37:
用甲醇溶胀了之后再还要用洗脱剂清洗上样是这样吗

Sephadex LH20简介
　　Sephadex LH20是一种价钱较高的填料，特点： 1、适合用有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济地大规模制备各种天然产物 2、结合凝胶过滤、分配色谱及吸附性层析于一身，分离结构非常相近的分子 3、载量可高达300mg样品/ml凝胶，极少需要再生，分离效果可保持十几年不变。
编辑本段Sephadex LH20 的原理
　　Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
编辑本段Sephadex LH20 洗脱溶剂
　　Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
编辑本段样品的处理和洗脱溶剂的选择
　　如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
编辑本段分离的技巧
　　（1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。　　（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。　　（3）馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。　　（4）洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。　　（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质　　（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。　　（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。

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4楼2011-03-14 14:44:36

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lengxin

木虫 (正式写手)

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xiaodu2007693(金币+3): 谢谢这么晚才奖励，辛苦了 2011-07-10 14:06:59

引用回帖:

Originally posted by 喜洋洋1024 at 2011-03-14 13:37:37:
用甲醇溶胀了之后再还要用洗脱剂清洗上样是这样吗

【转载】Sephadex LH-20的使用心得
http://www.wingene.net/bbs/viewthread.php?tid=80转自以上帖子，下面是帖子的内容，我复制下来的，如果觉得有点乱，可以打开上面的链接阿。

Sephadex LH20使用心得谈：

1 Sephadex LH20是一种价钱较高的填料，使用请千万注意，很贵的哟！（当然，老板有钱就另当别论拉）

2 先讲Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。听我讲完第2点后，其实就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 分离的技巧，最后说说我的使用心得

（1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。

（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。

（3）馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。

（4）洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。

（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质
（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用
问：在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?

解答如下:
1 "在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响."
当然有影响,Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何填料都是这样,只是Sephadex LH20很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯中收缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯作溶剂,如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：

water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
丙酮 0.8ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml

2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?"
样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同，但有时（其实是多数情况下），都办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是

1 样品一定要溶解（Sephadex LH20很贵，要保护填料，我看植化的同志对好填料看得都很重，职业问题，哈哈哈；同时，避免样品不溶解造成的脱尾）
2 溶解样品的体积尽可能小（色谱分离理论的基本要求，减小原始谱带宽度）
3 样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同（若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱能力强，则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力；同时若样品的溶解溶剂与洗脱的起使溶剂差别很大，样品可能以为溶解性的问题而析出。）
以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决定了。一般我的做法是满足1，2点，尽量满足第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解”，请注意我的陈述“尽可能”，

3 "还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?"
如果实验室Sephadex LH20很珍贵，分道较纯再用，如果实验室Sephadex LH20很普及，只要满足使用的注意事项，较粗的样品可直接使用Sephadex LH20分离。日本的师兄都是用Sephadex LH20粗分，人家有钱，所以不在乎。如果硅胶比Sephadex LH20还贵，你一定先用Sephadex LH20粗分，再用硅胶吧。有很多问题根本不是学术本身的问题，人也不可能在真空中搞科研。哈哈，跑题了。
问：那上样体积与柱体积最小的比是多少？我用100克的填料，如果样品不好溶，那一次最多能上多少毫升的样呢？

1 在分离过程中遇到要分离的样品量很大,而柱层填料相对较少的情况是很多的.一般解决的途径有两条:

1）将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍,这叫反复xxxx柱层，好处是工作量小（对比下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，可就乐去吧。

2 ）将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能保持完全一至，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的过程中，合的太粗，就如同将样品一次全上柱的合并结果，只是工作量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎么合并了。

所以推荐的做法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的方法来逐步提高分离效果，
唉呀，我嘴苯，不知有没有说清。

2 100g填料已不少了， astra兄的样品如果实在太多，就只好分开上柱了.

3 一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积的1／10吧。
问：分得效果不是很好，上了有8毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差不多，很让人困惑，郁闷。

不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说的是Sephadex LH20不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,

1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是Sephadex LH20这种填料的特点:"洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积",

2 "我用甲醇洗脱,而且仍然和没上柱之前差不多",说明你的样品组分之间分子大小差别不大,所以Sephadex LH20的凝胶过滤作用不起作用了,如果你还用Sephadex LH20分离,那你应该利用他反相分配的作用,即先用低浓度的甲醇/水,逐渐提高甲醇比例,最后才用甲醇洗脱.
1 A君提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理,是指甲醇水难蒸干吗?其实这根本不应成为问题.astra君请想一想,做植化的,哪有遇不到甲醇水的时候, ODS柱层用甲醇水洗脱, Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱,D101用乙醇水洗脱, HP20 用甲醇水洗脱, 高效液相最常用的是反相, 流动相还是甲醇水,可见甲醇水是植化同志最亲密的朋友! 所以蒸不干也要蒸,想想办法吗!

2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的,,办法是有的,先看看旋转薄膜的几个要素: 真空度, 冷凝液, 蒸发温度.

1) 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循环水一定要开,如果不开循环水,水泵中的水很快就会变得很热,将极大地减少水泵的效率,且会将抽出的溶剂挥散出来,很不好! 比国产水泵更好的是进口水泵,比进口水泵更好的是隔膜泵,系统的密闭性就更重要了,特别是蒸像水,丁醇这样的溶剂,对系统的密闭性的要求很高,对于系统密闭性不好时,可采用逐步拆分法来查漏,最容易出问题的地方在垫圈,国产的旋转薄膜配的垫圈很烂,全不耐氯仿等有机溶剂,当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂,垫圈就废了.所以要多预备几个垫圈.

2) 冷凝液一般使用水,如果配一台冷阱,使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液, 效果棒极了

3) 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化,国产旋转薄膜,水泵,用水冷,当然就只好提高蒸发温度了

我用东京理化的旋转薄膜,1/2汽车冷冻液冷凝,隔膜泵,蒸水不到45度,很爽!

3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度将大大提高!
Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,

2 如果柱子整个被污染,如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下
依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。

NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ,30g NaCl， 1000ml水
看了上面战友们的讨论，感觉受益菲浅。小弟也来班门弄斧，发言不对之处，请各位兄台指正：
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
我用Sephadex LH-20的步骤是：
1.选择条件：
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。
2.饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
3.样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。
4.湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
5.洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。
6.再生以备下次使用。
问：不知道用反响柱分离合用LH-20那个效果比较好.同时如果用同一根LH-20的话,洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题,上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?最后用甲醇冲柱就可以了吧??

1.Sephadex LH-20主要还是分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定的反相柱效果。如要分离的物质在反相板上分离效果好，那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物质分子量相差较大，当然是Sephadex LH-20效果好。实际使用中往往上在一起配合使用，逐渐细分为多个部分直到拿到纯品。
2.Sephadex使用时一般不进行梯度洗脱（洗柱的时候当然要换）。如果改变流动相的极性，会改变凝胶的膨胀率，分量不同的物质在网孔改变过程中引起交错，反而达不到分离效果。如果要分离的样品中极性相差较大，可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20
我们实验室用的LH-20柱一般就是甲醇：二氯甲烷（1：1）作流动相，如果冲不干净就换纯甲醇来冲，没碰到过你说的情况！根据LH-20在不同溶剂中的溶涨程度不同，如果你用的溶剂溶涨系数接近的话，可能影响不大，如果溶剂之间溶涨系数相差较大，我想出现气泡是可能的。（借用前面同学提供的数据）
以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
丙酮 0.8ml

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5楼2011-03-14 14:49:37

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