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多肽类药物制剂研究现状
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多肽类药物制剂研究现状 随着生物技术的发展，多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛，相应的制剂学研究也日益受到重视。与传统的小分子有机药物相比，多肽具有稳定性差，本文从稳定性、缓释系统、非注射途径给药三方面对多肽类药物制剂的研究概况进行介绍。 1 多肽的稳定性研究 1.1 引起多肽不稳定的原因 （1）脱酰胺反应 在脱酰反应中，Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行。在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。 （2）氧化 多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。 （3）水解 多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。 （4）形成错误的二硫键 二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。 （5）消旋 除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。 （6）β-消除 β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除，温度和金属离子对其也有影响。 （7）变性、吸附、聚集或沉淀 变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。 蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题，如riL-2在进行曲灌注时会吸附在管道表面，造成活性损失。 1. 2提高多肽稳定性的途径 （1）定点突变 通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。 （2）化学修饰 多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。 （3）添加剂 通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。 此外表面活性剂如SDS、Tween、Pluronic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。 （4）冻干 多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。 1. 3多肽类药物制剂的存放时间测定 对动力学行为符合Arrhenius，公式的稳定性预测不适合多肽制剂，这是因为在地行蛋白质药物加速实验时有三个问题难以解决：（1）多肽的降解途径较多，各途径活化能不同，升高温度会改变多肽降解的主要方式；（2）温度会改变多肽的构象，从而改变降解反应的活化能；（3）对冻干制品，若实验温度高于玻璃化温度（Tg），固体制剂将由玻璃态变为粘塑性状态，化学反应速率将急剧增加，从高于Tg获得的数据就不能外推到低于Tg 时的情况。但是，如果能解决上述问题，利用加速实验进行稳定性预测就可以成为评价多肽药物制剂的有效工具。 Yoshioka等人通过加速实验确定了六种多肽制剂在于25C存放的有效时间，结果表明与实测结果基本接近。这说明在一定条件下可用加速实验估算多肽制剂的货架时间，特别是在研究初期，用加速实验可节省大量时间和物力。但是，最终货架时间的确定还是需要采用留样观察法。 1．4多肽类药物制剂的分析手段 多肽类药物制剂研究常用的分析手段有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等到电聚焦电泳法、凝胶过滤层析法、反相液相层析法、紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、圆二色性光谱法、量热法以及生物活性测定法。这里仅介绍药物制剂研究中常用的一种方法——量热法（Calorimetry）。 量热法是通过测定样品在受热过程中的放热和吸热过程中的放热和吸热行为来研究样品在受热过程中的放热和吸热行为来研究样品中各组份的相互作用及状态变化的一种方法，常用的是差示扫描量热法（Differentiat Scanning Calorinetry）。该方法广泛用于多肽的热稳定性分析、各种添加剂对多肽结构的影响、多肽与配基之间的相互作用等研究，还用于测定冻干物品的玻璃化温度和共熔点。例如.Chan等用DSC研究了添加剂对rhDNase溶液热变性的影响。蛋白质浓度为10mg/ml,扫描速率为1.2C/ min。测得rhDNase在纯水中的Tm=67.4C,Hm=18.0J/g。加入Ca2+有利于rhDNase的热稳定，加入Mg2+、Mn2+则不利于rhDNase的稳定。当CaDl2浓度为20-100mmol/L时，Tm=76.4℃，Hm=20-22J/g。CaDl2和乳糖对rhDNase的稳定有符合作用。同时加50mmol/L CaDl2和100mg/ml乳糖，可使rhDNase的Tm值提高到76.4℃，Hm值到21.9J/g。Chang等用DSC测定了rhIL-lra制剂的玻璃化温度、反玻璃化温度和共熔点。冷冻蛋白制剂的各种物理变化，如玻璃化、反玻璃化和共熔点都会影响冻干过程。根据测定结果，作者确定了冻干温度和升温速度，仅用6个小时就完成冻干过程。 2 多肽类药物的缓释制剂研究 多肽类药物在血液中的半衰期一般很短，静脉注射后很快就被清除或降解，因此需要经常给药，给病人带来较多不便。为了减少给药次数可采用缓释或控释技术：（1）在注射液中加入高分子聚合物（如透明质酸），提高粘度、延缓药物扩散速度；（2）将多肽包裹在脂质体中，使多肽从脂质体中缓慢释放出来；（3）将多肽包裹在固体微粒中，使多肽从微粒中缓慢释放出来。 在上述方法中研究最多的是微粒递释系统，适于制备微粒的生物可降解材料有：聚乳酸、丙交酯和乙交酯共聚物（PLCA）、聚已内酯、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐、聚腈基丙烯酸烷基酯。 多肽的微囊大多采用聚酯材料，特别是用PLGA。PLGA微粒释放蛋白质的典型曲线分三相：起始爆释相、扩散控释相和分解控释相。起始爆释是指位于微粒表面或表面的蛋白质在几小时内的快速释放。扩散控释是蛋白质通过微粒中孔道阔但释放相必须与分解控释相重叠，聚合物分解形成的孔隙使包裹的蛋白质连续释放，而主要的困难是降低起始爆释，增加药物载量。 已用该法制备了许多台和多肽的微粒剂型，如LHRH、TRH、Insulin、GH、SOD、TNF、IFN、IL-2、EPO等。其中LHRH类似物le-uprolide的微粒制剂可控制释放药物长达一个月，并于1988年首先在法国上市，随后又在欧美40个国家上市，1993年起在我国销售。美国Genetech公司 的研究人员也成功地制备了连续释放一个月的rhGH和IFN-γ微囊制剂。 |
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