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wms65352003银虫 (小有名气)
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谈谈淋巴瘤诊断病理
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淋巴瘤病理学诊断要求回答两个基本问题：1、是不是淋巴瘤？2、是哪一种淋巴瘤？也就是淋巴瘤的诊断问题和淋巴瘤的分类问题。这两个基本问题是淋巴瘤病理学发展的原动力，激发了淋巴瘤诊断病理学的发展和进步。20世纪80年代以前对淋巴瘤的认识主要在组织形态学的水平。80年代中期以后随着多项新技术的出现，作为临床前沿的淋巴瘤研究接纳了各种新技术，从蛋白水平和分子水平进行了广泛的研究，取得了长足的进步，走在其它疾病研究的前列。 一、 淋巴瘤的诊断 1、淋巴瘤诊断困难的原因 淋巴瘤的诊断和鉴别诊断是临床病理诊断中最困难的领域。原因是：1、正常淋巴细胞与肿瘤性淋巴细胞难以分辨；2、淋巴结结构较难辨认，特别是在T区淋巴组织增生状态下，结构紊乱和结构破坏难以辩清；3、淋巴细胞具有游走性，难以确定是正常游走还是“转移”；4、淋巴瘤组织中混杂着数量不等的反应性淋巴细胞；5、淋巴瘤本身的复杂性：瘤细胞具有多样性（细胞大小：有小-中-大-巨细胞；细胞形态：有圆形、卵圆形、肾形、梭形、印戒细胞形、间变形、不规则形等）、生长模式的多样性（结节、弥漫、结节弥漫混合、窦内生长、上皮巢样生长等）、生长部位的广泛性（可以发生在人体的所有系统和器官，概括起来可分为淋巴结内和淋巴结外，也可以是局灶性的，也可以是白血病样的播散性的）、瘤细胞的可变性（低度恶性转化成高度恶性、霍奇金淋巴瘤转化成非霍奇金淋巴瘤）。由于以上原因以及制片质量差的人为因素容易在实际工作中出现误诊或漏诊。 2、淋巴瘤诊断的形态学标准 由于淋巴瘤的复杂性，至今仍然没有一个具有普遍性的诊断标准。不过，人们还是在大量实践的基础上建立起了一些诊断标准[1，2]，例如：1、正常组织结构破坏，可以是全部破坏，也可以是部分破坏；2、出现单一呈片异型的淋巴细胞，3、一定数量的异型淋巴细胞浸润正常组织（如血管、神经、脂肪、上皮等）。这些诊断标准可以适用于大多数典型的淋巴瘤病例。但是仍然还有部分淋巴瘤不能满足这些标准，如霍奇金淋巴瘤和T细胞丰富的B细胞淋巴瘤，这些淋巴瘤虽然存在组织结构破坏，但瘤细胞散在分布而不呈片。另外，早期淋巴瘤的诊断标准也是一个难题。众所周知，早期诊断是取得良好治疗效果的重要因素。其它很多类型肿瘤已有了早期诊断标准，如原位癌、局部早期浸润癌等，而淋巴瘤的早期诊断标准至今仍然没有建立起来，主要原因是早期淋巴瘤难以辨认（结构破坏不明显，呈片异型细胞面积的大小难以界定），其次是淋巴瘤细胞也能游走，很难从形态学上进行早期的界定。淋巴组织“不典型增生”也是人们关注的一个问题。从理论上讲，肿瘤的发生发展是一个长期的逐渐的过程，从正常组织到增生，从增生到非典型增生，再到肿瘤。这个过程经过了一个从正常组织到肿瘤组织的中间阶段，因此，有的疾病就有了“交界性病变”或“中间型病变”的诊断名称。淋巴组织疾病是否存在“交界性病变”仍然有不同看法。文献中提出过淋巴组织“不典型增生”，国内和国际上也有人在使用，但是淋巴组织“不典型增生”的标准却难以界定。有文献[3]将一下情况视为“不典型增生”：（1）“淋巴滤泡出现5个以上大小、形状一致的增生,且缺乏星空现象；（2）副皮质区出现淋巴结1/3以上区域的融合及一致性增生；（3）粘膜相关淋巴组织(胃肠道、涎腺等)增生呈灶性一致性单核样B细胞区。这些标准是否能获得广泛认同尚不清楚。 形态学是淋巴瘤诊断的基础，至今为止仍然是最主要、最重要的诊断手段，不可偏废。同时免疫组织化学和分子生物学技术是淋巴瘤诊断的重要辅助手段，对准确诊断淋巴瘤，特别是区分淋巴瘤的类型非常有帮助。 3、免疫组织化学与淋巴瘤诊断 淋巴瘤诊断的难点之一是淋巴组织的结构在形态学上不易辨认，而免疫组织化学分析有助于辩清淋巴组织结构。所谓免疫结构（Immunoarchitecture）[4，5]，即通过免疫组化染色显示淋巴造血组织的结构，包括肿瘤性和（或）非肿瘤性淋巴细胞、辅助性非淋巴细胞及血管、淋巴窦、网状纤维的数量和分布模式，从整体上把握疾病的结构特征，对疾病进行诊断和鉴别诊断。例如：CD3和CD20等抗体可以了解T细胞和B细胞的数量和分布模式，CD21等抗体可以通过显示滤泡树状突细胞了解淋巴滤泡是否存在和分布情况，从而判断结构是否有破坏。又如：正常情况下，CD3和CD5阳性细胞的数量和分布模式基本一致，如果病变区域表达CD5和CD20，而不表达或很少表达CD3，提示病变很可能是B细胞淋巴瘤（B小淋巴细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤）。类似的情况还见于，病变同时表达CD20和CD43，而不表达或很少表达CD3，提示病变可能是B细胞淋巴瘤。因为CD5和CD43在正常T细胞和部分B细胞淋巴瘤中表达。Cyclin D1的表达可见于淋巴瘤细胞和其它组织的细胞，但是至今尚未发现非肿瘤性的淋巴细胞表达Cyclin D1[6]。Bcl-2是鉴别反应性淋巴滤泡和滤泡性淋巴瘤的又一有效抗体。一般来讲，反应性淋巴滤泡呈阴性反应，滤泡性淋巴瘤则呈阳性反应。应用Bcl-2抗体可以鉴别大多数滤泡性淋巴组织病变的良恶性，特别是发生在淋巴结的病变。但是，部分皮肤滤泡性淋巴瘤可以不表达Bcl-2[7]，应特别注意。 免疫组织化学快速发展，各种各样的抗体不断涌现，相信有助于鉴别淋巴组织良恶性病变的抗体会越来越多，越来越有效。 4、克隆性分析与淋巴瘤诊断 由于从组织形态学上难以完全解决淋巴瘤的诊断和鉴别诊断问题，人们必然寻求形态学以外的办法。细胞克隆性检测就是辅助解决良恶性淋巴组织病变的重要进步。从理论上讲，肿瘤是从单个瘤变的细胞发展而来，因此，肿瘤细胞群具有同样的遗传学特性，即单克隆性。采用免疫组织化学和流式细胞学方法[8]可以从蛋白水平检测一群B淋巴细胞是否具有单一的免疫球蛋白（Ig）轻链Lambda或Kappa（因为一个B细胞只可能有其中一种轻链），如果这群细胞或绝大多数细胞只表达一种轻链，这群细胞就具有单克隆性，因此，可理解为具有肿瘤的特性，但是，是否诊断为淋巴瘤还必须结合形态。流式细胞学在分析B淋巴细胞的克隆性方面具有比免疫组化更高的敏感性，在西方国家已广泛应用，在我国开展还不普遍。另外，Ig轻链mRNA原位杂交也可以了解B细胞克隆性。Southern blot和PCR方法通过检测Ig重链（IgH）和轻链（IgL）基因是否发生了克隆性重排了解B细胞的克隆性。对T细胞的克隆性检测，目前使用较广泛的是采用PCR方法检测T细胞受体基因（TCR）是否发生了克隆性重排，但是目前尚没有有效的抗体和探针用于检测TCR抗原和TCR mRNA。除了通过Ig（基因）和TCR检测淋巴细胞的克隆性外，也有报道采用人类雄性激素受体基因在X染色体上失活的分析方法（HUMARA）研究淋巴细胞的克隆性[9]。细胞克隆性检测方法的出现是淋巴瘤诊断病理学的一大进步，对疑难病例的良恶性鉴别具有很大的帮助。但是，这些克隆性检测方法并不是万能的，并不能解决所有的疑难病例。Ig基因克隆性重排和TCR基因克隆性重排的敏感性只能达到90%左右，也就是说，即使是淋巴瘤也有大约10%的病例检测不到克隆性重排，也就是假阴性。另外，虽然这种方法的特异性很高，但也并不是百分之百。有报道显示少数淋巴组织反应性增生病变和非淋巴组织的病变也可检测到IgH克隆性重排[10]，并且在一些小组织活检（如针吸活检、内镜活检）以及微切组织和切片刮取组织中更容易出现克隆性重排[11]。出现假阴性的原因主要是DNA的质量不佳或引物没有与靶基因有效的结合。出现假阳性的原因是DNA质量不佳、分析的细胞数量太少或发生了交叉污染。因此，在使用这些方法是应该扬长避短。 在日常工作中，HE染色和免疫组织化学染色基本上可以对大多数淋巴组织良恶性病变做出诊断和鉴别诊断，特别是对B细胞病变，因为，对形态难以确定良恶性病变的病例，可以选择Bcl-2、Lambda和Kappa免疫组化染色或流式细胞学辅助诊断，一般可以确定诊断。如果少数病例仍然不能确定诊断，还可以选择PCR进行IgH克隆性重排的检测。因此，目前B细胞病变已不是诊断和鉴别诊断中最困难的问题了。但是，T细胞病变的良恶性的诊断和鉴别诊断还不太乐观，原因是至今还没有找到能够确定T细胞克隆性的有效抗体或辅助鉴别良恶性的抗体，另外，TCR基因的家族成员众多，难以用简单的PCR方法进行检测，并且，TCR各个克隆之间的差异很小，用普通的凝胶电泳不易分辨，容易将多克隆判断为单克隆，造成假阳性增多。近几年发展起来的基因扫描（genescan）[11]可以很好地解决分辨率的问题，只是仪器太贵，不易普及。 二、 淋巴瘤的分类 1、淋巴瘤分类回顾 大量的临床实践发现淋巴瘤的治疗效果有很大差别，预后有明显的不同。这些发现提示淋巴瘤不是单一疾病，很可能是发生在淋巴细胞的多种不同的疾病，淋巴瘤只是这些多种淋巴细胞肿瘤的统称。将这些不同种类的淋巴瘤区分开来，对于更有效地治疗病人、了解疾病的预后有非常重要的作用。因此，对淋巴瘤需要进行分类。从临床方面很难对淋巴瘤做出准确诊断，更难对淋巴瘤进行分类。淋巴瘤的分类主要靠病理学。20世纪70年代中期以前的分类都是建立在纯形态学基础上的。虽然出现过众多的分类，但是由于淋巴瘤的复杂性，难以建立一个公认的分类，实践也表明只靠形态学是不能完成理想的淋巴瘤分类。70年代中期，Kiel分类和Lukes-Collins分类引入了免疫学的成果，将非霍奇金淋巴瘤分为T细胞和B细胞两大类。形成了现代分类的雏形。随后的20多年中，免疫组织化学和分子生物学的快速发展，为淋巴瘤分类提供了大量新的客观资料。1994年欧美学者将形态学、免疫组织化学和分子生物学研究成果应用于淋巴瘤分类，提出了REAL分类。随后经过5年的修正并融入了临床资料，经过75位病理学者和44位临床学者共同努力，最后在2001年形成了WHO淋巴造血组织肿瘤分类（以下简称WHO分类）[7]。由于WHO分类结合了形态特点、免疫表型、分子遗传学特征和临床特点4方面的资料，又经过病理和临床学者的广泛长期讨论，因此，WHO分类得到了国际上普遍认同，它是至今为止最科学的分类，是国际间、病理与临床之间交流的共同语言，是淋巴瘤认识史上的里程碑，是淋巴瘤研究成果的集中体现，是多项科学成果的结晶。 2、淋巴瘤分类的新认识 早期认为淋巴瘤是单一疾病，后来分出了霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤，认识到这是两个不同的疾病，再后来非霍奇金淋巴瘤分为了T细胞和B细胞两大类，现在已认识到淋巴瘤至少包括了30种独立的疾病。霍奇金淋巴瘤有2种，非霍奇金淋巴瘤中的T/NK细胞淋巴瘤有15种，B细胞淋巴瘤至少有13种[7]。每一种淋巴瘤在形态学、免疫表型、遗传学和临床方面都有自己的特点，因此，从客观上或实际中能够将不同类型的淋巴瘤区分开来。过去对NK细胞认识很少，现在知道NK细胞在免疫表型和功能上与T细胞有不少相似之处，比如NK细胞表达部分T细胞标记和细胞毒性分子标记，并且具有细胞毒性功能。因此，WHO分类将NK细胞肿瘤与T细胞肿瘤放在了一起。过去一直认为淋巴瘤与淋巴细胞白血病是两个完全不同的疾病，而现在研究发现两者的本质是相同的，不同的只是他们的表现形式，例如淋巴母细胞淋巴瘤与急性淋巴细胞性白血病，发病人群常常在儿童，恶性度都很高，形态学都表现为中等大小的母细胞，免疫表型都表达TdT，细胞遗传学上都有多种类型染色体异位。很多年来一直不清楚霍奇金病的性质和肿瘤细胞的起源，近年来采用免疫组化、单个细胞微切技术结合IgH和TCR分析技术证明了霍奇金病中的肿瘤细胞来源于淋巴细胞，并且绝大多数来源于B细胞，同时还证明了肿瘤细胞具有单克隆性。因此，也改名为霍奇金淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤目前包括了结节性淋巴细胞为主霍奇金淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤两个类型，后者还包括4个亚型（富于淋巴细胞型、结节硬化型、混合细胞型、淋巴细胞消减型）。以往常用细胞的大小来判断淋巴瘤的侵袭性，即小细胞侵袭性弱，大细胞侵袭性强。近年来通过染色体异位分析方法从过去的小淋巴细胞瘤中发现了一个新品种---套细胞淋巴瘤。套细胞淋巴瘤虽然细胞体积小，但侵袭性很强。相反，细胞体积很大的间变性大细胞淋巴瘤，特别是皮肤原发性间变性大细胞淋巴瘤的侵袭性很弱，预后很好。弥漫大B细胞淋巴瘤是一组细胞和组织形态不同的大B细胞淋巴瘤，由于免疫表型、遗传学特征和临床特点没有显著差别，因此将其暂时视为同一种淋巴瘤。但是新近采用的基因芯片方法研究发现弥漫大B细胞淋巴瘤至少两种不同细胞起源的淋巴瘤，一种起源于生发中心细胞，另一种起源于生发中心以外的活化B细胞，两者的预后有显著性差异[12]。近来还发现纵膈原发性大B细胞淋巴瘤具有不同于普通弥漫大B细胞淋巴瘤的独特分子谱系，提示可能是一种独立的淋巴瘤类型，它的分子谱系类似于经典霍奇金淋巴瘤结节硬化型的分子谱系，表明这两种类型的淋巴瘤可能是同一疾病两极的表现形式，在它们中间存在着一些形态和免疫表型都介于两者之间的中间型淋巴瘤（即灰色淋巴瘤） [13]。这些进展显现出分子谱系或基因表达谱系的研究在未来淋巴瘤的分类中，甚至在淋巴瘤预后的预测和治疗方法的选择中会起到越来越重要的作用。 3、致病因素与淋巴瘤类型 近年的免疫组化和分子生物学研究还发现部分淋巴瘤与某些病原体有密切关系。比如地方性Burkitt淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、鼻型NK/T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、肠病性T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎性T细胞淋巴瘤与EB病毒有密切关系。胃黏膜相关组织边缘带B细胞淋巴瘤与幽门螺杆菌有密切关系。原发渗漏性淋巴瘤与疱疹病毒VIII有关。成人T细胞淋巴瘤/白血病与人类T细胞淋巴瘤病毒I（HTLV-1）有关。同时还发现部分淋巴瘤的分子遗传学相关因素。比如，套细胞淋巴瘤与t（11，14）；滤泡性淋巴瘤与t（14，18）；间变性大细胞淋巴瘤与t（2，5）等[7]。 三、结语 经过20年左右的快速发展，人们对淋巴瘤的认识有了很大的提高，对淋巴瘤分类有了统一的认识。但是淋巴组织良恶性病变的诊断和鉴别诊断以及淋巴瘤的早期诊断问题仍然没有很好的解决，特别是T细胞增生性病变与T细胞淋巴瘤的鉴别在常规工作中还非常困难。从各个方面（包括制备新抗体、新探针等）寻找有效的鉴别诊断方法是今后研究的方向。分子生物学将对未来淋巴瘤更准确地分类产生革命性影响，DNA芯片技术在其中一定会起到关键性作用。因此，为了淋巴瘤诊断病理学的提高和发展应该积极地吸收各种有用的先进技术。 参考文献 1. Lennert K, Feller AC. The diagnosis of lymphoma. In: Lennert K, Feller AC, eds. Histopathology of non-Hodgkin’s lymphomas. 2nd ed. Springer-Verlag, 1992. 1-6. 2. Feller AC, Diebold J. Histopathology of nodal and extranodal non-Hodgkin’s lymphomas, based on the WHO classification. 3rd ed. Springer, 2004, 409-414. 3. 纪小龙. 淋巴瘤病理及临床诊断中的几个特点。临床误诊误治2000，13：177-178. 4. Wirt DP, Grogan TM, Jolley CS， et al. The immunoarchitecture of cutaneous pseudolymphoma. Hum Pathol. 1985，16:492-510. 5. Ottaviani G, Bueso-Ramos CE, Seilstad K, et al. The role of the perifollicular sinus in determining the complex immunoarchitecture of angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Am J Surg Pathol. 2004，28:1632-40. 6. Harris NL, Stein H, Coupland SE, et al. New approaches to lymphoma diagnosis. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2001:194-220. 7. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, et al. World Health Orgainization classification of tumors. Pathology and genetics of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press, 2001. 8. 阎占清，刘志广。流式细胞分析在淋巴瘤诊断中的应用。中华病理学杂志 2002，31：293-294。 9. Delabie J, Tierens A, Gavriil T, et al. Phenotype, genotype and clonality of Reed-Sternberg cells in nodular sclerosis Hodgkin's disease: results of a single-cell study. Br J Haematol. 1996, 94:198-205. 10. Wan JH, Sykes PJ, Orell SR, et al. Rapid method for detecting monoclonality in B cell lymphoma in lymph node aspirates using the polymerase chain reaction. J Clin Pathol. 1992, 45:420-3. 11. Zhou XG, Sandvej K, Gregersen N, et al. Detection of clonal B cells in microdissected reactive lymphoproliferations: possible diagnostic pitfalls in PCR analysis of immunoglobulin heavy chain gene rearrangement. Mol Pathol. 1999, 52:104-10. 12. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 2000, 403:503-511. 13. Calvo KR, Traverse-Glehen A, Pittaluga S, et al. Molecular profiling provides evidence of primary mediastinal large B-cell lymphoma as a distinct entity related to classic Hodgkin lymphoma: implications for mediastinal gray zone lymphomas as an intermediate form of B-cell lymphoma. Adv Anat Pathol. 2004, 11:227-38. |
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