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基因工程载体
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基因工程载体 最起码的条件： 1. 能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制； 2. 具有合适的限制性内切酶位点，在载体上单一的限制性内切酶位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源DNA片段方便地插入载体 3. 具有合适的筛选标记，如抗药性基因等 4. 在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增 5. 载体的相对分子质量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段，载体的相对分子质量太大将影响重组体或载体本身的转化效率 6. 在细胞内稳定 性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失。 载体有克隆载体和表达载体，表达载体有胞内表达和分泌表达载体。 表达载体必须含有： 1. 强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录； 2. 在启动子下游区和ATG(起始密码子)上游区有一个好的核糖体结合位点序列(SD)； 3. 在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。 在大肠杆菌中常用的启动子有Lac、Trp、Tac以及来自λ噬菌体的强启动 子PL、PR以及来自T7噬菌体的T7启动子等。斌几类启动子可被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别而起始转录，而T7启动子必须由T7噬菌体来源的T7RNA聚合酶所识别而起始转录。 选择克隆载体时应考虑： 1. 所要用的限制性内切酶； 2. 将要插入的外源DNA片段的大小； 3. 是否要在E.coli中表达所要克隆的基因； 4. 所具备的筛选方法等。 当我们用大肠杆菌作为受体菌去表达一个外源基因时，如果所用的表达载体中的启动 子是λ噬菌体的PL或PR启动子，为了使外源基因通过热诱导来表达，就必须用可表达温度敏感的cI857阻遏蛋白基因的菌株作为受体菌。但当选用的载体本身就含有并表达ci857基因时，则其受体菌就不受是否含有cI857的限制。同样的道理，当利用Lac或Tac启动子来表达外源基因时，受体菌必须是Lac I+菌株，除非载体上含有Lac I基因。又如当用T7噬菌体启动子表达外源基因时，由于T7启动子只能为其本身的RNA聚合酶所识别，所以所用受体菌一定能表达T7RNA聚合酶。 选用受体细胞的一般原则： 1. 根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选； 2. 遗传稳定 性高，易于进行扩大发酵，易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率； 3. 受体细胞内内源蛋白水解酶得志因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累； 4. 可使外源基因高效表达； 5. 对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清过关基中进行培养； 6. 受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性； 7. 无致病性； 8. 具有好的转译后加工机制等。 在原核细胞中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点(SD)、起始密码与SD序列之间的距离和核苷酸组成、mRNA的二级结构以及mRNA上游的5’端非翻译序列和蛋白编码区的5’端序列等。 作为翻译起始，可达最大效率的一般原则是： 1. AUG(ATG)是最首选的起始密码子，GUG、UUG、AUU和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择； 2. SD序列也即核糖体结合位点(RBS)的序列，是指核细胞mRNA 5’端非翻译区同16SrRNA 3’端的互补序列。按统计学的原则，一般的SD序列至少含AGGAGG序列中的4个碱基，SD序列的存在对原核细胞mRNA转译起始至关重要； 3. SD与起始密码之间的距离以9±3为适宜。也有报道，如果SD序列同16SrRNA 3’端的互补碱基大于8时，上述二者之间的距离则不重要； 4. 除SD序列外，处于起始密码5’端的核苷酸应该是As和Us(在-3位置应为A)； 5. 如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高； 6. 在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件如AUG、SD序列易被核糖体识别和结合。 基因融合表达外源蛋白的原因： 1. 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解，有时可以 通过产生融合蛋白避免目标基因产物被快速降解，从而稳定表达产物的产率。特别是表达一些小肽基因时，这是一种好的策略； 2. 通过与一特异性的蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到快速、有效的回收、纯化。如将外源蛋白基因同金黄色葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域形成融合蛋白，可利用免疫亲和层析的办法，对融蛋白进行纯化； 3. 通过与特定的肽段进行融合表达，可以将表达的外源蛋白质定向地定位存宿主细胞的不同区位。如通过和信号肽相融合，使外源蛋白分泌到细胞周质或培养基中； 4. 通过同特定蛋白午形成融合蛋白，然后再通过体外切割去除融合部分，是获得天然蛋白的一种更可靠和可重复性的方法。如在E.coli中表达的真核蛋白，往往带有甲酰甲硫氨酸的N-末端，如果与特定蛋白序列形成融合蛋白，通过其后的特异性切割，可以获得具有完全天然序列的外源蛋白质分子； 5. 通过与特定的蛋白质(如硫氧还蛋白)形成融合蛋白，使外源蛋白在细胞内进行可溶性表达，防止包涵体的形成。 基因融合的策略： 1. 最简单的融合方式是将重组基因直接剪接于适当的信号肽序列之后。这种设计的优点在于，如果在转运过程中信号肽被正确的加工，那么产生的重组此致就可具备天然的N-末端。如用大肠杆菌生产人生长激素和人的表皮生长因子时，就是将外源基因接到phoA信号肽的后面进行分泌表达的。应该指出，并非任何外源基因加上信号肽序列后都可以分泌表达； 2. 将外源基因本身按阅读框架自我融合。这种方式对一些小肽的稳定表达尤其重要。如由DSDGK五肽组成的抗IgE形成的活性肽基因，首 尾相连成二十八聚体，再同二氢叶酸还原酶基因融合，可以 得到高效表达的五肽产物。也有报道，胰岛素原的双体在E.coli细胞中比单体更稳定。这种设计方式，融合蛋白往往以包涵体的形式存在，但也有可溶性表达； 3. 目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C端或N融合。C端融合的优点是，启动子和翻译起始信号都处于基因的5’端，因此在3’端所进行的不同基因片段的融合，并不改变原启动子和翻译起始信号的原设计，因而目标基因的表达水平相对来说可预测。N端融合的缺点是，目标基因产物特异性的转录和翻译起始元件必须在目标基因的5’端设计好。此外，在以后的分离纯化过程中，当用化学方法去释放目标蛋白时，切割后残留的氨基酸残基通常保留在C末端，这样使目标蛋白序列成为非天然蛋白序列。其优点是，基因融合产物的直接N末端序列易于操作和进行各种可能的生物活性表达测试，象对HIV基因阅读框移码研究中，就采用N端融合； 4. 分泌-亲和融合，此种设计是将分泌和亲和纯化的优点结合起来，即N端为信号肽，然后是融合蛋白伙伴，再接目标基因。产物能分泌到培养基中可为以后的纯化、连续发酵和收集表达产物提供方便； 5. 双亲和融法。此方法是将目标基因X，同两个分别对两个不同配基有特异性亲和的异源结构域A、B，以A-X-B的形式进行融合。这样的设计为以后选择性利用亲和层析树脂进行纯化提供方便。这一设计适用于表达对此致水解高度敏感的蛋白，通过两次连续的亲和层析，对即使表达量不高的蛋白也可以相当好地回收。应该指出的是，在设计双亲和融合体系时，要对于两个亲和结构域的可溶性、大小、稳定 性、与配基的结合常数、亚基结构等进行充分的研究；而表达结果是使目标基因可以折叠成为有生物活性的结构，而不受位于其同侧的序列 所影响。然而这一方法的麻烦之处是在融合设计时，要在目标蛋白X的N端和C端设计同个合适的切割位点，以使目标基因的表达产物从同侧结构域中分离出来。 6. 分泌-插入融合法。此方法是将目标基因插入到信号肽序列和一插入序列之间，此插入序列是为一种可插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编码，这种设计的目的是用以将受体或抗原定位于细菌的外表面或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒。这样的系统对于开发疫苗，或产生具免疫原的复合物是有意义的。 |
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