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2009227004金虫 (正式写手)
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【分享】几种蛋白质定量方法的实际应用 已有6人参与
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几种蛋白质定量方法的实际应用 定量作为生物实验室的日常工作之一，具有非常重要的意义。在蛋白质组学研究中，我们常常需要对蛋白质进行快速定量。无论是对蛋白质表达谱的定量比较还是蛋白质理化性质的分析，都建立在准确的定量这一基础之上。蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。 由于DNA具有的5'-磷酸腺嘌呤，5'-磷酸胞密啶和5'-磷酸鸣嘌呤在紫外光谱的260 nm处产生很灵敏的特征峰，我们可以以此对DNA进行定量测定。相似的，由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，所以任何一个蛋白质都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，我们可以对其进行定量。紫外吸收法测定蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。但该法存在无法弥补的缺陷。首先，对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。其次，若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正。 因此，实验室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法进行测定蛋白质含量。其原理为，蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。只需将eppendorf管换为ELISA板并相应的减少各个试剂的用量，这种方法可以应用到大规模高通量的试验中，可以同时进行384个样品的全自动准确定量。 另一种可供选择的蛋白质定量方法为Lorry法。其原理为，蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。Amersham公司将Lorry法进行了改良并商品化。首先用沉淀剂和共沉淀剂沉淀蛋白质，这样可以消除样品中的色素、尿素和盐等干扰因素。然后用含Cu2+的复溶剂溶解蛋白质，再加入显色液进行定量。这种方法的优点在于定量准确，对各种干扰因素的容忍度都比较高，但是由于引入了沉淀复溶的操作步骤，使得该方法比较耗时，而且容易沉淀复溶不完全，影响结果的准确性。 纵观三种蛋白质定量方法，各有优缺点。紫外吸收法适合于与色谱柱联用，达到实时监控，然而较不准确。Bradford法适合于大规模测定样品，但是样品中不能含有太高浓度的去污剂，对样品的要求较高。改良的Lorry法不再排斥去污剂，相对的操作就比较复杂。我们需要在试验中按照要求选用不同的定量方法。 |
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