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【求助】问一个很专的问题“免疫荧光双标技术检测海马突触素I表达”检测方法 已有2人参与
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在文献上看到： 将爬有原代培养海马神经元用PBS漂洗后，冰甲醇40℃固定10min；PBS洗片5 min×3次，加入10%羊血清，室温孵育30min；吸弃羊血清封闭液，加入1:400稀释的突触素I，4℃孵育过夜；PBS洗片5 min×3次，滴加l:50稀释的FITC标记的羊抗体IgG，避光室温孵育2h；避光PBS洗片5min×3次，滴加PBS-甘油稀释的DAPI，封片。激光共聚焦显微镜下观察，LSCM激光共聚焦荧光断层扫描成像系统采集图像，进行叠加处理，合成FITC和DAPI共定位的突触素I图像。 个人感觉好像不对，不知道哪位老师做过这放面的实验。给指点指点。 另外还有一个 免疫荧光双标法检测海马神经元p-CREB的表达：常规操作制备冰冻切片，切片在10%山羊血清封闭液中室温孵育lh后，同时加入两种第一抗体为兔抗p-CREB(1:100)和小鼠抗NeuN(1:100)4℃湿盒孵育过夜，然后加入荧光二抗(羊抗兔IgG-TRITC l:50，羊抗小鼠IgG-FITC 1:50)室温孵育2 h。每次抗体孵育后均用PBS漂洗，5 min×3次。最后用含有防淬灭剂的甘油/碳酸盐缓冲液(l:l)封固，荧光显微镜进行观察、拍片。病理图像分析软件计算神经元染色积分光密度值(IOD值)，IOD值与p-CREB表达成正比，以IOD值反映p-CREB的表达。 这个个人感觉对，还请高手确认，谢谢。 以上材料是参考一博士论文。 |
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