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[交流]
【求助/交流】PCR遇到的问题
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各位同仁，大家好！最近我一直在PCR，可是一直没有很亮的目的条带出现或者目的条带很模糊，非特异性扩增很严重！我想用目的条带做下一步PCR的模板，导师给我设置的两个引物，其中一条28个碱基，另一条58个碱基，后者还有两个突变碱基，分裂为三片段，长度为23，13，20。模板是质粒，已经跑胶验证，质粒质量不错。Pfu, rTaq, ExTaq这三种酶都已经试过，pfu能扩增出目的条带，但是条带模糊，非特异性严重，rTaq能扩增出目的条带，但较模糊，引物二聚体严重，特异性扩增较好。Extaq 没有目的条带，只有引物二聚体。其他的加样基本上都是按照使用说明书加的，也征求过师兄师姐的建议。可是结果还是那个样，跟导师讨论，他让我自己探索条件。退火温度我也已经升到62度了，我也尝试过菌落PCR，可还是老样子。下一步的打算就是设个退火温度梯度，但愿会出来理想结果……不知各位同仁有什么建议没？不胜感激……我是新手，请大家伙不吝赐教…… |
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