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[交流]
【求助/交流】PCR遇到的问题
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各位同仁,大家好!最近我一直在PCR,可是一直没有很亮的目的条带出现或者目的条带很模糊,非特异性扩增很严重!我想用目的条带做下一步PCR的模板,导师给我设置的两个引物,其中一条28个碱基,另一条58个碱基,后者还有两个突变碱基,分裂为三片段,长度为23,13,20。模板是质粒,已经跑胶验证,质粒质量不错。Pfu, rTaq, ExTaq这三种酶都已经试过,pfu能扩增出目的条带,但是条带模糊,非特异性严重,rTaq能扩增出目的条带,但较模糊,引物二聚体严重,特异性扩增较好。Extaq 没有目的条带,只有引物二聚体。其他的加样基本上都是按照使用说明书加的,也征求过师兄师姐的建议。可是结果还是那个样,跟导师讨论,他让我自己探索条件。退火温度我也已经升到62度了,我也尝试过菌落PCR,可还是老样子。下一步的打算就是设个退火温度梯度,但愿会出来理想结果……不知各位同仁有什么建议没?不胜感激……我是新手,请大家伙不吝赐教…… |
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