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挥汗如雨

至尊木虫 (职业作家)

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[交流] 【求助/交流】TCA法提取蛋白最后溶解离心出现大量粘稠透明的胶状物质，是什么原因啊？

近一次用TCA/丙酮法提取植物叶片总蛋白,在最后丙酮洗涤沉淀凉干、裂解液再溶解后离心取上清时，在上清和沉淀物之间出现大量粘稠透明的胶状物质，以前重来没有过这种情况。求助蛋白高手指点这是什么原因造成的？如何避免再出现类似情况？这些粘稠透明的胶状物质难道是难溶的蛋白？是由于这次操作沉淀凉干时间过长，造成蛋白不可逆变性聚集难溶？

下面是我这次提取具体过程：

TCA/丙酮法
（1）  将植物叶片样品 250 mg液氮研磨粉末重悬在1.5 ml TCA提取缓冲液中，-20℃放置过夜(以前做时是6小时)，蛋白会形成白色沉淀。
（2）  5000g，4℃离心15min。用Tip头小心吸取上清丢弃。
（3）  在沉淀中加入1.6 ml冰预冷的丙酮，5000g，4℃离心10min。用Tip头小心吸取上清丢弃。
（4）  重复步骤2-3次。
（5）  将沉淀晾干（这次感觉比以前晾干时间长），使用800 ul裂解液溶解沉淀。(由于实验做到这步已经半夜了，所以就放入-20℃过夜,第二天才做的下一步。以前做都是直接进行下一步)
（6）  40000g，4℃离心30min。取出上清，测定蛋白质浓度。（这步在上清和沉淀物之间出现大量粘稠透明的胶状物质，以前重来没有过这种情况）

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1楼 2010-11-26 01:03:29

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