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挥汗如雨

至尊木虫 (职业作家)


[交流] 【求助/交流】TCA法提取蛋白最后溶解离心出现大量粘稠透明的胶状物质,是什么原因啊?

近一次用TCA/丙酮法 提取植物叶片总蛋白,在最后丙酮洗涤沉淀凉干、裂解液再溶解后离心取上清时,在上清和沉淀物之间出现大量粘稠透明的胶状物质,以前重来没有过这种情况。求助蛋白高手指点这是什么原因造成的?如何 避免再出现类似情况?这些粘稠透明的胶状物质难道是难溶的蛋白?是由于这次操作沉淀凉干时间过长,造成蛋白不可逆变性聚集难溶?

下面是我这次提取具体过程:

TCA/丙酮法
(1)  将植物叶片样品 250 mg液氮研磨粉末重悬在1.5 ml TCA提取缓冲液中,-20℃放置过夜(以前做时是6小时),蛋白会形成白色沉淀。
(2)  5000g,4℃离心15min。用Tip头小心吸取上清丢弃。
(3)  在沉淀中加入1.6 ml冰预冷的丙酮,5000g,4℃离心10min。用Tip头小心吸取上清丢弃。
(4)  重复步骤2-3次。
(5)  将沉淀晾干(这次感觉比以前晾干时间长),使用800 ul裂解液溶解沉淀。(由于实验做到这步已经半夜了,所以就放入-20℃过夜,第二天才做的下一步。以前做都是直接进行下一步)
(6)  40000g,4℃离心30min。取出上清,测定蛋白质浓度。(这步在上清和沉淀物之间出现大量粘稠透明的胶状物质,以前重来没有过这种情况)
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