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himrwang

铜虫 (初入文坛)

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金黄色葡萄球菌基因组提取方法---求教

1，采用CTAB提取，

01吸取1ml培养的菌体于离心管中，12,000 rpm离心15 s，用200μL无菌
水重悬，再离心去掉上清液，加入467μL TE和24μL浓度为10mg/mL的溶菌酶，37度振荡30 min，加入54μL浓度10%的SDS溶液，68oC温浴15 min后加入87μL浓度为5 M的NaCl溶液和69μL浓度为1％的CTAB溶液，68oC温浴15min。加入600μL苯酚-氯仿异戊醇混合溶液(25:24:1,v/v/v)，12000 rpm离心10 min，取上清液于新离心管中，加入60μL冰乙醇，-20oC静置1h。12000 rpm离心10 min后，去上清液，用70％乙醇清洗。最后用20μL无菌水稀释备用

02《KaliaA.etal.，1999;林万明》，1991):取300ul菌悬液，以3000rmp离心10min；取沉淀加入1ml 70%的乙醇混匀后，放置0℃静置20min，以3000rmp离心10min，收集菌体，加入TE缓冲液共467ul，20mg/ml的溶菌酶12ul和1ul RNase(1mg/ml)，0℃ lh，并间隔摇晃几次，取出放置一20℃置20min，立即放入68℃水浴10min，加入10%的SDS 53ul 68℃水浴15min，取出加入5mol/LNacl 87ul，CTAB/NaCI(1%CTAB，0.73mol/LNaCI)69ul 68℃水浴15min，一20℃置30min，取出加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，离心取上清;再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，离心取上清;加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，离心取上清；最后用2倍体积的冰的无水乙醇混匀，一20℃静置30min，离心去上清，沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于50ul双蒸水中，保存于一20℃。

问题01：方法01中加入CTAB水浴68度15分钟后，没有一20℃置30min，省略了这一步，这样对吗，而方法02有，

问题02：方法01中直接加入600μL苯酚-氯仿异戊醇混合溶液(25:24:1,v/v/v)，而方法02，取出加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，离心取上清;再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，离心取上清;加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，来回共弄了3次，为什么要先用氯仿/异戊醇(24:1)混匀，离心取上清，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，离心取上清，然后再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，

看了没有呢

[ Last edited by himrwang on 2011-1-5 at 21:35 ]

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[ Last edited by himrwang on 2011-1-5 at 21:39 ]

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