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中药有效成分常见色谱前处理方法
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第一步：提取法： 用相应的溶剂使有效成分溶解出来的，溶剂根据有机物的性质来选择。可以冷浸，如果稳定性允许，为加速溶解的过程，可采用超声处理，加热回流（包括索氏提取）。选择适当的溶剂可以减少杂质。基本原则是能用纯的甲、乙醇不用带水的，能用非极性的不用极性的，因为消除极性杂质一般比非极性的麻烦。根据相似相溶的原则，非极性溶剂溶解的极性物质较少。 蒸馏（多为水蒸气蒸馏）也较多使用，同时具有提取和一定的分离作用。 某些物质还可以用升华法：樟脑，咖啡碱（178℃以上就能升华而不被分解）等。升华法易产生挥发性的焦油状物，粘附在升华物上，不易除去，另外，升华不完全，甚至会分解，不能用于含量测定。 第二步：分离和纯化： 1、液液萃取 基本上都是水溶后，用乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚等与水不相溶的有机溶剂。一般分析的量较少，微溶于水的物质都可以用液液萃取的方法。通过合适的酸化/碱化步骤，可有效的去除杂质。 2、沉淀 利用重金属等与待分析物形成络和物或难溶盐沉淀而分离，然后再用酸、碱等把它还原出来。铅盐常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。例如含绿原酸的溶液加醋酸铅溶液，搅拌使沉淀，离心，弃去上清液，沉淀物加5％硫酸溶液，用醋酸乙酯萃取。常用雷氏铵盐使生成生物碱沉淀析出。橙皮甙、芦丁、黄芩甙均易溶于碱性溶液，加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白质，可以变更溶液的pH值利用其在等电点时溶解度最小的性质而使之沉淀析出。此外，还可以用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等。 3、析出法：包括盐析和改变溶剂极性析出。 盐析法是在水溶液中、加入无机盐，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。三七皂甙乙、掌叶防己碱，小檗碱等都可以用这种方法。不过，一般分析上是在水溶液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取，例如麻黄碱、苦参碱等水溶性较大的物质。 改变溶剂极性析出是在溶液中加入不同极性的溶剂是物质析出。就像生产中水提醇沉、醇提水沉。 4、柱色谱法： 常用的固定相有硅胶、氧化铝、聚酰胺、大孔树脂、活性炭、硅藻土等。柱色谱法有两种，一种是简单的吸附解吸，理论塔板数相当于一，跟萃取差不多，也可称富集，例如像现在用得很广的SPE（solid phase extract）。另外一种则是像色谱先驱Tswett那样，样品加在柱上形成一窄带，然后再分步或连续洗脱。 第一种较简单，活化后，按要求预处理，然后让样品溶液通过吸附剂，吸附饱和后，根据不同物质的解吸条件，选择不同吸脱溶剂吸脱下来。关于SPE小柱的使用这里不介绍了，仅举一个更实际的例子：取天麻细粉5g，加甲醇50ml，水浴加热回流1小时，过滤，滤液蒸干，残渣加水30ml溶解，用氯仿萃取2次，每次10ml，弃去氯仿液。水液加热挥去残余氯仿，加活性炭（不活化）2g，微沸20分钟，放冷，加硅藻土1g，搅拌均匀，用滤纸过滤，再以40ml水洗涤残渣，滤液弃去；残渣于水浴上干燥半小时，然后置锥形瓶中，加无水乙醇50ml，回流半小时，过滤，滤液浓缩至干，加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。其实，如果不是含量测定的话，上面的做法可以达到目的。如果是含量测定，那就要用柱子，并确定一下吸附剂的使用量，防止待测物损失。 第二种方法，最重要的是让样品在柱上形成窄带。我们可以近似的认为，窄带的高度相当于理论塔板高度，柱长除以理论塔板高度就是理论塔板数了。实际上洗脱时，待测成分在柱上的实际高度不一定等于窄带的高度。如果用洗脱剂直接溶解样品，就可以直接上柱了。如果不是的话，就要用一定的吸附剂吸附样品，在把样品的溶剂挥干后，在加到柱子。洗脱条件应通过实验确定，包括洗脱溶剂、洗脱体积、洗脱速度。 根据不同的吸附剂，具体的应用不同： （1）硅胶：硅胶颗粒表面有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键作用吸附水分而降低吸附能力，硅胶的吸附性根据其含水量不同分成多个级别。硅胶的活化：100～110℃时，硅胶表面水分即能被除去；500℃时，硅胶表面的硅醇基脱水缩合转变为硅氧烷键，失去吸附性。硅胶是酸性吸附剂，用于中性或酸性成分分离。不活化的硅胶，可利用分配原理分离色素。硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，所以可作为离子交换剂，分离碱性化合物。吸附硅胶柱的洗脱溶剂成很多，从非极性到极性的顺序洗脱。 （2）氧化铝：氧化铝偏碱碱性，最适宜用于生物碱类的分离，不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。氧化铝用水洗至中性，称为中性氧化铝，中性氧化铝适用于酸性成分的分离。氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理，可使氧化铝颗粒表面带有硝酸根或氯离子，制成酸性氧化铝，酸性氧化铝具有离于交换剂的性质。中性氧化铝使用最多，柱层析用的中性氧化铝粒度应在100～200目之间。粒度大，分离效果差：小则洗脱速度慢，纵向扩散。中性氧化铝的活化与硅胶差不多。中性氧化铝柱的洗脱溶剂溶剂组成很多，从非极性到极性的顺序洗脱。 （3）聚酰胺：尼龙与酰胺类化合物形成的高分子聚合物，分子上有很多酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物形成氢键。适用于酚性化合物如黄酮的分离。一般聚酰胺不需活化或预处理就可以装柱。提取液或提取物上柱后，用水洗杂质，用不同比例的醇的水溶液从低浓度到高浓度依次洗脱。 （4）大孔树脂：具有立体结构的多孔性聚合物，有巨大的比表面积，通过范德华力吸附有机物。以前的大孔树脂多用汽油等作致孔剂，需要用丙酮加热回流来预处理，现在可购买纯度较高的，使用前只需用甲醇、或乙醇洗涤至洗出液滴在水中不产生白色即可。再生树脂的方法是，用2%～5%的盐酸浸泡洗涤，用水洗到中性，然后用5%氢氧化钠浸泡洗涤，用水洗到中性即可。树脂含水量70%左右，如不慎树脂干了，可用乙醇或丙酮浸渍处理，然后再用。按实际情况，酸、碱浓度可增减。大孔树脂类型很多，最多用的是D101。多用于皂苷、黄酮、内酯、萜类和色素的分离。提取液或提取物上柱后，用水洗杂质，用不同比例的醇的水溶液从低浓度到高浓度依次洗脱。 （5）活性炭：一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后再用。上柱用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。提取液或提取物上柱后，用水洗杂质，用不同比例的醇的水溶液从低浓度到高浓度依次洗脱。 （6）硅藻土：采用不同pH缓冲液的硅藻土分配色谱柱，可分离生物碱、酸性生物碱和中性物质。提取液或提取物上柱后，用乙醚或氯仿洗下色素、脂肪、中性杂志，然后用胺性醇洗下生物碱。 十八烷基硅烷基硅烷碱合硅胶、其它类型键合硅胶、DEAE纤维素、其他纤维素、离子交换树脂应用的较少，这里略去。 |
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