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genghong2006

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[交流] 线粒体融合与分裂------一个古老而崭新的课题

本人对线粒体颇感兴趣，已发表有关它的文章数篇，线粒体在生物体内的作用和意义不容置疑，对它的介绍在任何一本细胞生物学方面的书上都能找到。
我想说的是关于线粒体融合与分裂的话题，现在在国外研究得很多而我国竟无人全面开展对它的研究，以下是本人根据国外文献写成的有关线粒体融合机制的综述，已在细胞生物学杂志发表，现摘录出来供有志于此研究的学者参考，竭诚欢迎志同道合者一起交流补充。对这一古老而崭新的课题进行深入探讨。

   线粒体是重要的半自主性细胞器，在新陈代谢和生物能量转换中处于中心地位。线粒体的特殊功能以及线粒体DNA（mtDNA）的特殊性[1]使mtDNA极易受到活性氧攻击而发生突变，人类许多疾病(如早衰、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、糖尿病、癫痫、癌症等)都与线粒体基因组的突变有关[2]。近年来的研究表明，线粒体不仅参与了细胞凋亡过程[3]，而且线粒体融合对线粒体正常功能的发挥也具有非常重要的作用[4]。实际上，线粒体的融合(fusion)与其相反过程---线粒体分裂(fission)是细胞内的基本事件，起初是从酵母的连续切片中，后来用聚焦显微镜从活着的真菌和Hela细胞中观察到：线粒体可以在细胞内形成一个高度动态而连续的网状结构(或网络)，连续不断地进行融合与分裂,与此有关的蛋白质在线粒体之间进行混合与交换[5]。酵母细胞中如果线粒体融合发生障碍，可引起呼吸链出现缺陷[4]; 精子发生过程中减数分裂时线粒体融合一旦受阻，或者受精后精卵细胞的线粒体融合不能正常进行，则必然波及生殖和发育过程，因此，线粒体的融合现象一直就引人注目。鉴别线粒体融合蛋白、阐明线粒体融合机制，对于更全面地了解线粒体的功能、更好地理解线粒体的起源与进化、搞清线粒体与退行性疾病、衰老及癌症的关系等都有重要意义。本文从介绍受线粒体融合所影响的线粒体形态与分布开始，对线粒体融合过程以及与线粒体融合有关的蛋白质进行论述。
   1.　线粒体的形态与分布
   线粒体是一个高度动态的细胞器，它的形态和分布具有很大的可塑性[6]。尽管其内部组织结构高度保守，但线粒体的外部形状却随细胞种类及其生理状态的不同而呈现多样性(有棒状、球形、细丝状等)，即使是同一细胞内，由于所处的部位不同，其形状也各有差异。虽然在一些细胞中线粒体是均匀分布于整个细胞质的，但在多数情况下，线粒体位于细胞质特定的区域，而不是随机分布[6]，这与它的供能机能有关，线粒体在细胞中的形状与位置反映了细胞的能量需求。
   是什么控制着线粒体在细胞内的形态与分布呢？在活细胞内，线粒体定位及运动与微管、微丝、中间纤维都有关系，不仅这些细胞骨架成分在细胞周期的不同时相发挥的作用不同，而且以微管和肌动蛋白为基础的摩托蛋白(motor proteins)、驱动蛋白(kinesin)以及细胞质动力蛋白(cytoplasmic dynein) 通过水解ATP把化学能转变为机械能也参与了线粒体的运送和分布。除此之外，线粒体形态很大程度上依赖于线粒体的连续融合与分裂[7]。在细胞生长过程中，线粒体不断进行融合与分裂，例如在出芽酵母和一些哺乳动物细胞中，观察到线粒体融合与分裂间保持动态平衡，线粒体藉此维持其高度分支和管状的网络结构，这种结构可更好地促进能量与代谢物的分配以及化学和电子信号的传递[8]。在肝脏疾病、肌肉营养失调、心肌炎、癌症中，可发生线粒体分布和形态的改变[9]，这与线粒体融合与分裂间的失衡有关。线粒体融合与分裂间的失衡还可导致巨型线粒体 (megamitochndria) 出现，常见于病变的肝细胞、恶性营养不良患者的胰脏细胞、白血病患者骨髓的巨噬细胞中[9]。
      2. 线粒体融合过程
尽管线粒体融合与分裂是细胞内常见而普通的现象，但它发生的详细机制尚不明了，已发现一些与线粒体分裂有关的蛋白质[10]，而与线粒体融合有关的蛋白质却知之甚少，甚至目前的研究连细胞内线粒体的融合频率(frequency)也不能给出[11]。
   在真核细胞中，存在着众多具有生物膜的细胞器，如线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体、过氧化物酶体等，还存在着内吞(endocytosis)与外排(exocytosis)作用，因此膜融合成为相当重要的过程。细胞内单层膜的融合涉及SNARE(soluble NSF receptors)蛋白、SM(Sec/Munc 18 homologs)蛋白、Rab蛋白(一种20～25kDa的小分子量GTP酶)等[12]，但线粒体的融合似与上述几种蛋白质无关[6]。因线粒体既有内膜又有外膜，介导线粒体融合需要特殊的“融合装置(fusion machinery)”，并满足下列条件：(1)必须能提供融合线粒体间一个特定的识别方式；(2)必须能提供能量，以克服膜融合时的能量障碍；(3)必须与分裂过程密切协作以维持线粒体网络的连贯性；(4)必须将外膜融合与内膜融合耦联起来。由于线粒体融合过程涉及四层膜，因而出现两种可能的融合方式：第一，线粒体内膜融合与外膜融合协同进行，由一个共同的“融合装置”操纵；第二，内膜融合不与外膜融合同步，即外膜和内膜有各自的“融合装置”，内膜可能在外膜完全融合之后再启动自身独立的“融合装置”进行融合。理论上来说前者对细胞更经济有效，而由Fritz S等[13]的实验也证实线粒体融合确实采用的是第一种方式(见图1)。
线粒体融合步骤简要归纳如下：
  ①锚定(docking)：见图1(a)，两个要融合的线粒体由“融合装置”将它们锚定在一起，锚定部位称之为接触位点(contact site)。接触位点易于分布在线粒体的什么部位呢？从电镜观察中，人们早已发现线粒体的外膜和内膜在一些地方紧密并列(apposition)，进一步用电子显微断层照相术看到在这些地方内膜与外膜紧贴在一起（但仍能彼此分开），而其它地方的内膜则向内折叠形成“嵴（cristae）”。这些紧密结合的位点除了可使蛋白质穿过线粒体膜、使磷脂移动、使能量代谢顺利进行外，在不同阶段它的蛋白组成还可能不同[14]。在接触位点上有“融合装置”的成分，当两个彼此互相靠近的线粒体外膜并列在一起时，“融合装置”被激活，可能“融合装置”暴露于胞质溶胶（cytosol）的部分行使锚定功能。
②外膜融合。见图1(b)，主要表现为两个线粒体外膜脂质分子的混合(outer membrane lipid mixing)，通过“融合装置”的介导完成该过程。
③内膜融合。见图1(c)，这是关键性的一步，可能伴随着融合复合物内部分子的重排。当外膜融合之后，两个线粒体内膜之间的障碍被消除，此时，内膜上并不产生新的“融合装置”，也不需要再形成一个新的锚合环使两个内膜并列，而是由同一个“融合装置”通过自身结构的变化将外膜的融合与内膜的融合耦联(coupling)起来，立即启动内膜融合。如果没有这种耦联，内膜脂质的混合会明显缺乏效率。
④基质内含物的融合。见图1(d)，内膜融合后经过融合复合物内部分子的重排，“融合装置”恢复常态，内膜与外膜行使正常功能，两个线粒体的基质内含物互相混合(matrix content mixing)。线粒体合二为一，融合过程完成。
   从图1中看出，线粒体融合过程的关键之处在于膜的融合，而膜融合必然涉及膜的重要成分――脂质双分子层的变化，线粒体外膜间的融合如此，内膜亦然。虽然目前尚不清楚“融合装置”中的蛋白质是如何与脂类相互作用的，或者说脂类变化是受何信号控制，但有关脂质双分子层在膜融合时的转化过程还是可以作一个大致描述的，比较流行的观点是“茎体假说(stalk hypothesis) [12]”。以外膜融合为例，当两个要融合的膜锚定在一起时，膜与膜之间的水合排斥力减弱、脂双层结构稳定性降低，甚至经历一个非双分子层的阶段。非双层结构形成的倾向性越大，则膜融合的速度越快。在茎体模型中，一旦两个相靠近的磷脂双分子层之间的排斥力被减弱，则两个近端单分子层会高度弯曲、合并，形成半环形(semitoroidal)结构，类似植物的茎，起“桥梁”作用，随后，远侧的单分子层被拉入茎腔内，成为从两侧内陷的窝(dimple)，称为亚稳定过渡态(metastable transition state)，也叫半融合(hemifusion)状态。两侧凹陷的单分子层继续聚拢，并向扁平拉伸，继而形成盘状的隔膜(diaphragm), 随着隔膜的延伸和中断，融合孔出现，融合后的膜逐渐恢复为脂双分子结构。主要变化过程见图2，其中的细微变化则有待于更多实验进行观察。至于内膜的融合，虽然基本过程类似于外膜，但由于蛋白质和脂类的分布量有很大不同(一般来说，外膜中蛋白质和脂类各占50%；而内膜中蛋白质占80%，脂类占20%，且大部分蛋白质系ATP酶复合物)，因而融合速率和融合方式必定有所差异，这些差异目前尚不得而知。
      3. 与线粒体融合有关的蛋白质
以上复杂的融合过程仅由一两个蛋白质是不可能胜任的，它需要多种成分协同作用，目前所知，线粒体“融合装置”是一个大约800kD的大型蛋白复合物[7]，具有GTP酶活性。以下介绍的三种蛋白可能与该“融合装置”有关。
(1) Fzo蛋白――第一个被发现的介导线粒体融合的蛋白质
虽然在许多不同类型的细胞中都能看到线粒体膜的融合现象，如出芽酵母、丝状真菌、培养的哺乳动物细胞和各种植物细胞等，但人们首先在果蝇（Drosophila）中发现Fzo蛋白介导线粒体融合，这是一种与膜相连的GTP酶，由基因fuzzy onions(fzo)编码。其名称的由来是在雄性fzo突变体内，当缺乏fzo基因产物时，精子发生过程中线粒体仍能聚集（aggregate），却不能融合，成为“毛绒绒的洋葱(fuzzy onion)”状结构，这种结构产生的是有缺陷的精子，可导致雄性不育[7]。后来，在酵母中发现了参与线粒体融合的Fzo蛋白的同源物――Fzo1p。Fzo1p不仅对于维持酵母细胞内带分支的管状线粒体网络是必需的，而且对mtDNA的维持也很重要，因为fzo1突变体内线粒体成为断片、细胞中缺乏mtDNA[8]。
Fzo1p位于线粒体的外膜上，具有朝向细胞质的NH2/COOH拓扑(topology)结构，该部分含有GTP酶域（GTPase domain）和两个复合螺旋区（coiled coil regions），以利于与邻近线粒体的联系，而暴露于膜间隙（IMS）的部分则与内膜组分相互作用（完整的膜间隙对于Fzo1p与内膜的紧密联系至关重要），因而可能参与内膜的融合，并充当耦联外膜融合与内膜融合的使者。由于Fzo1p具有与蛋白质间相互作用有关的复合螺旋区、有提供能量的GTP酶域以及能将能量与脂质双分子层混合相耦联的跨膜区（transmembrane domains），因而成为“融合装置”的关键成分、膜融合的必备元件。另外，Fzo1p还可能充当调节因子(regulatory factor)的角色，把外膜和内膜中的融合蛋白招募（recruit）到接触位点上，从而激活“融合装置”。
   (2) Ugo1p和Mmm1p----新近发现的为线粒体融合所需的蛋白质
新近发现的线粒体外膜蛋白----Ugo1p对线粒体融合也是必要的。Ugo1p含有大约200个氨基酸的羧基(-COOH)端面向IMS，与“融合装置”内膜上的成分相作用，具有线粒体能量转移蛋白的特征[14]。虽然Ugo1p突变体和fzo1突变体内都因线粒体融合受阻而产生断裂的线粒体，但二者也有不同，断裂的线粒体在Ugo1p突变体内倾向于聚集，而在Fzo1突变细胞中却仍然是分散的，说明Fzo1p和Ugo1p这两种蛋白可能都是“融合装置”的一部分，它们介导融合的不同步骤，相互间不发生作用[14]。由于Fzo1p和Ugo1p在线粒体外膜上均匀分布，而线粒体融合却主要发生在线粒体管尖上，因此，很可能它们只是在两个线粒体锚定时才被激活。这样，出现了三种可能的融合方式：一种方式是Fzo1p通过在一定时间激活“融合装置”而担任调节线粒体融合的分子开关；另一种方式是融合时“融合装置”的各组分在接触位点短暂集中，融合完成后各自解散；第三种方式是线粒体在沿管状的任何地方都能融合，但融合的启动由线粒体间的联系所控制。
除了Fzo1p和Ugo1p外,线粒体融合还需要Mmm1p(mmm, mitochondrial morphology maintenance)。Mmm1p位于线粒体外膜上，维持线粒体形状是Mmm1p的作用之一，它与Mdm10p和Mdm12p等共同作用，参与线粒体与细胞骨架成分的联系[15]，通过介导线粒体与细胞骨架间的相互作用而维持线粒体拉长的形态、保持线粒体分支状的网络结构、保证线粒体融合与分裂的顺利进行。在缺乏Mmm1p的细胞内，线粒体网络转变为一个巨型球状体[16]。
另外，Mmm1p还可能参与“线粒体骨架”或“线粒体支架（mitoskeleton）”的构成，由它介导线粒体外膜和内膜间的联系，并与mtDNA相作用，这一骨架对保持mtDNA拟核（nucleoid）的稳定是必需的，缺乏Mmm1p将导致“线粒体骨架”以及mtDNA的结构出现严重改变[17]。但是，由于Mmm1p是线粒体外膜上的整合蛋白，而mtDNA位于线粒体基质中，它们是如何作用的呢？很可能包含Mmm1p的复合物与mtDNA是间接联系，通过一种或数种内膜蛋白与mtDNA作用，可也不排除Mmm1p或Mmm1p复合物的其它成员与mtDNA拟核直接作用的可能性，因为线粒体内膜蛋白Tim23p的氨基端就是穿过线粒体外膜而直接进入胞质溶胶中的[18]。因而Mmm1p也可以相似的方式，通过横跨外膜和内膜进入线粒体基质中而与mtDNA建立联系，介导线粒体融合信号的传递，并在相邻线粒体接触位点的形成上扮演一定角色。
4. 结语
综上所述，线粒体融合是细胞内独特而复杂的过程，需要多种成分的参与和调节。Fzo1p、Ugo1p、Mmm1p构成“融合装置”的一部分，它们在线粒体融合过程中既互相联系又发挥各自的功能，其中Mmm1p介导线粒体形状的维持，为融合提供一个稳定的环境；Ugo1p介导融合时的能量传递，可能在外膜融合与内膜融合的耦联中起一定作用；Fzo1p不仅参与融合线粒体间的锚定、激活“融合装置”，而且参与内膜融合，并充当耦联外膜融合与内膜融合的中介。不过，总的说来，对与线粒体融合有关的蛋白质掌握得还很不全面、对线粒体融合过程（尤其是膜脂与膜蛋白间的相互作用）了解得还很不具体，关于线粒体融合机制仍需做深入细致的研究。

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