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三七五参汤抗心肌缺血损伤及其与HSP70表达关系的研究
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关键词心肌缺血；中药治疗；热休克蛋白 中图分类号R542．2 文献标识码B 长期以来，不少学者致力于寻找保护缺血心肌 的有效措施，70年代至今，许多药物已经应用于心 肌保护的实验和临床研究，但其效果却并不理想。 近年来，有学者发现动物经热休克预处理并恢复一 定时间后，能明显减轻缺氧一再给氧所致的心肌损 伤。进一步研究表明，这种保护作用的机制与热休 克预处理诱导心理细胞合成了一组新的蛋白质一热 休克蛋白(heat shock protein，HSP)有关。这种改变 传统的外源性药物治疗方法，从心肌细胞内部寻找 抗损伤潜能的探索，引起了当今心脏病学家的注意。 将热休克预处理直接应用于人体显然是不现实的， 因此，研究能够诱导产生热休克蛋白，激发机体内在 抗损伤机制的药物就引起众多学者的兴趣。目前， 这方面的研究方兴未艾，但有关中药的研究尚未见 报道。本组通过对缺血损伤大鼠心肌组织中HSP7 定量和定性的观察，探讨中药三七五参汤对缺血心 肌的保护作用及与HSP70表达的关系。 1 材料与方法 1．1 动物清洁级Wistar大鼠40只，雌雄各半， 体重200"250g，由华中科技大学同济医学院实验 动物中心提供。 1．2 药品与试剂 1．2．1 药品制备三七五参汤由红参、三七、丹参、 沙参和苦参等药物组成，每ml液体含生药2g，武汉 市中医院制剂室制备提供。 1．2．2 试剂盐酸异丙肾上腺素纯品(上海禾丰制 药厂)兔抗人HSP7。抗体、辣根过氧化物酶(HI )标 记的鼠抗兔IgG(加拿大Laval大学Robort教授惠 赠)，3，3一二氧基联苯胺(DAB)显色液，Sgacfl~用型 试剂盒(武汉市博士德生物工程公司进口分装)，CK 试剂盒(北京中生生物公司)，十二烷基磺酸钠 (SI)S)、甲醇、"Iris等其他化学试剂购于市售，级别 为分析纯。 1．3 主要仪器GL一20B高速冷冻离心机(武 汉)，SHI一水浴恒温摇床(江苏太仓医疗厂)，高压 电泳仪(江苏兴华分析仪器厂)，722型分光光度计 (上海)，CS一930双波段色谱扫描仪(日本)等。 1．4 方法40只大鼠随机分为对照组、模型组、热 处理组和三七五参汤组，每组10只。三七五参汤组 大鼠按16m|／kg剂量给予三七五参汤灌胃，其他3 组按16ml／kg剂量给予0．9％生理盐水灌胃，连续 处理7d。7d后，热处理组给予热休克预处理，24h 后造模。 1．4．1 热处理方法按Currie等⋯1的方法进行， 热处理组动物经腹腔注射3％戊巴比妥钠(45mg／ )，麻醉后置于热环境中，使其肛温达到42℃ ，并 维持15min然后置于室温中恢复24h。热处理过程 中，按2ml／100g腹腔注射生理盐水，以补充高温时 丢失的体液。其余各组动物麻醉后置于室温中。 24h后开始造模。 1．4．2 造模方法采用White等的方法，除对照 组外，其余各组按500mg／kg剂量背部皮下3点注 射盐酸异丙肾上腺素，对照组皮下3点注射等容积 生理盐水，24h后重复1次，再过24h后处死动物， 采集标本。 1．4．3 标本采集各组大鼠剖腹，腹主动脉采血，低 温分离血清备测。剪开胸廓，取心脏，除去心包膜、心 房和右心室，横切切取心尖部组织2mm×2mm，常规 石蜡包埋备用。同时另取心肌组织0．2g，剪碎，以含 250mn~l／L蔗糖、5mn~l／L EDTA 和10mmd／L磷酸 缓冲液(pH 7．4)为介质冰浴下制成心肌匀浆，低温2 000r／rain离心10min取上清液备测。 1．5 心肌HSP70定量和定性检测采取Western 法l。J检测心肌组织匀浆中HSP70含量；按SABc即用 型试剂盒操作步骤进行免疫组化检测，光镜下观察 心肌组织l_ISP70表达情况。 1．6 心肌组织肌酸激酶(CK)检测和病理切片制作 采用酶促偶联连接法检测心肌组织CK含量；心 肌组织石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。 1．7 统计学方法二组间均数比较采用t检验，样 本率的比较采用检验。 2 结果 2．1 血清CK水平模型组大鼠血清CK水平显 著高于对照组(P<0．01)，三七五参汤组和热处理 组CK水平均低于模型组(P<0．01)，而三七五参 汤组与热处理组之间CK水平差异无统计学意义 中国心血管病研究杂志2004年6月第2卷第6期Chinese Jmm~t ofCardiovascularReview June2004，Vo1．2，．No．6 ‘471 (P>0．05)。见表1。 表1 各组动物血清CK水平比较I ±S) 注：*与对照组比较P<0．01；△与模型组比较P<0．01；#与：七五参 汤组比较P>0．05 2．2 心肌组织病理切片观察光镜下观察模型组 心肌组织切片，在心内膜下和心肌内可见境界清楚 的坏死灶，并见大量炎症细胞浸润，部分心肌纤维肿 胀、断裂和融合；而三七五参汤组和热处理组心肌缺 血损伤情况较模型组显著减轻。 2．3 心肌组织HSP70表达水平从实验结果可以 看出，模型组心肌HSP7n含量显著高于对照组(P< 0．01)，三七五参汤组心肌HSP7n水平显著高于模型 组和对照组(P均<0．01)。热处理组心肌HSP7n表 达水平最高，与其他3组比较差异均有统计学意义 (P均<0．01)。见表2。 表2 各组动物心肌HSP70表达水平(j± ) 注： 与对照组比较P<0．01；△ 与模型组比较P<0．01；#与三七五参 汤组比较P<0．01 2．4 心肌组织免疫组化观察对照组大鼠心肌细 胞中可见少量HSP7n散在分布于胞质中，模型组，热 处理组和三七五参汤组大鼠心肌细胞胞质HSP7n表 达和HSlP70免疫阳性细胞数目明显增多，并且可见 细胞核中表达，增强部位以胞质为主，尤以热处理组 和三七五参汤组表达显著。 3 讨论 冠心病属祖国医学“胸痹”、“真心痛”等病范畴， 病机多为心之气阳不足，兼有痰、瘀等标实之患，日 久则阳损及阴。而见阴虚之证。三七五参汤是全国 著名老中医章真如教授治疗胸痹的经验方，以人参 补阳气之不足，以沙参、玄参滋阴，三七、丹参活血化 瘀，苦参燥温清热，以防人参过热和沙参、玄参之滋 腻。临床疗效显著。我们在前期的临床和动物实验 中发现该方能够显著缓解胸痹的临床症状，减少稳 定型心绞痛发生频率和心肌梗死后恶性心律失常的 发生率，并且具有降低氧自由基和升高超氧化物歧 化酶等作用，对心脏具有明显的保护作用。 3．1 HSP 与心脏保护当机体受到过热、缺血、 缺氧等刺激时，机体会分泌一种具有保护作用的蛋 白质。1974年，Tissieres等_4 J采用凝胶电泳的方法 首次从经过热处理的果蝇唾液中分离出这种蛋白 质，并命名为“热休克蛋白”(heat shock protein， HSP)，后人根据HSP分子量的大小，将其分为 HSP90、HSP7n、HS 0和小HSP 4种。HSP对心肌的 保护主要是通过其“分子伴侣”作用来实现的。 HSP7n是目前发现的主要分子伴侣之一，能与蛋白 分子结合，保护新合成蛋白分子的恰当构型，防止在 正确的多聚体形成前，蛋白亚单位有恰当的折叠和 聚集；陪伴蛋白分子在细胞内转运、跨膜，参与蛋白 质的折叠、伸展和多聚复合体的组装；当蛋白质受损 变性时，能促使其恢复或加速其降解和消除，以维护 细胞的功能和生存。本组实验通过经典的热休克预 处理诱导大鼠产生热休克蛋白，随后用异丙肾上腺 素皮下注射复制大鼠心肌缺血损伤模型，结果显示： 热处理组大鼠心肌CK水平显著低于模型组(P< 0．01)，病理切片也显示热处理组大鼠心肌损伤程度 较模型组明显减轻，而心肌组织中的HSP70表达水 平则明显高于模型组和正常组，与CK水平和心肌 病损伤呈显著负相关；免疫组化研究也显示热处理 组心肌组织中HSP7n表达较模型组和正常组显著。 实验结果与White等_2 J的实验结果相符。提示 HSP7 可能对心肌组织具有保护作用，其机制可能 与其“分子伴侣”作用有关。 3．2 三七五参汤对心肌缺血损伤的保护作用动 物实验结果表明，模型组大鼠血清CK水平显著高 于对照组大鼠(P<0．01)。光镜下观察病理切片可 发现心肌组织有明显的缺血损伤，在心内膜下和心 肌内出现大量境界清楚的坏死灶，周围有大量炎性 细胞浸润，部分心肌肿胀、断裂、融合。而三七五参 汤组大鼠血清CK水平高于对照组，但显著低于模 型组(P均<0．01)，病理切片亦显示三七五参汤组 大鼠心肌缺血损伤程度较模型组明显减轻，与血清 CK水平相符，说明三七五参汤对心肌缺血损伤具 有显著的保护作用。Western和免疫组化结果显示 三七五参汤组大鼠心肌组织中HSP70的表达较正常 组和模型组明显为高，与CK水平和心肌病理组织 切片损伤情况呈显著负相关，说明三七五参汤对缺 血心肌的保护作可能与其诱发HSP7(】表达有关。但 值得注意的是，热处理组大鼠心肌HSPr0表达较三 七五参汤组显著(P<0．01)，但二组血清CK水平 维普资讯http://www.cqvip.com ． 472 ． 中国心血管病研究杂志2004年6月第2卷第6期Chinese J0un1al ofCardiova~darReview J哪e2004，Vo1．2，No．6 差异并没有统计学意义，而且心肌病理损伤情况也 没有明显差异，说明三七五参汤对心肌的保护作用 可能除诱发HSP70表达外，尚有其他途径，值得进一 步研究探讨。 4 参考文献 [1] Currie RW，Karmazyn M，Kloe M，et a1．Heat shock re~onse is associated with enhanced postischemic ven— trieular recovery[J]．Circ Res，1998。63：543—549 [2] White FP，White SR．1soproterenol induced myocardial necrosis is associated wi th stress protein synthesis in rat heart and thoracic aorta[J]．Circ Res，1986，20：512— 515 [3] 何晓生，潘秋萍，邬堂春．Western斑点印迹法检测主 要热应激蛋白[J]．中华劳动卫生与职业病杂志， 1996，14(6)：376—378 [4] Morimoto RI，Tissieres A，Georho~ los C，et a1．Stress biology and medicine[M]．Harbor：Spring Laboratory press，1990：210 [2003—10—01收稿 维普资讯http://www.cqvip.com |
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