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[交流] LI-6400光合作用测定仪在生态学研究中的应用

LI-6400光合作用测定仪在生态学研究中的应用

　　摘要： 1971年美国LI-COR公司成立，其产品广泛应用于全球的100多个国家和地区，已成为从事植物生理及生态学研究的科学家的首选仪器。LI-COR公司的生态仪器应用于农学、生物技术、植物学、生态学、林业、园艺、湖沼生物学、气象学、海洋学、光学研究、植物生理学和日光研究等不同学科。
1997年基因有限公司成为LI-COR公司在中国（包括香港地区）的独家代理商，2002年成立LI-COR产品部, 全权负责其产品在上述地区的市场推广、销售和售后服务等工作。在近几年的中科院、教育部和农业部及林业局的国家重大项目中，光合作用测量系统几乎全部采用了LI-COR公司的LI-6400系列。

LI-6400并非单一用于研究植物光合作用，他同时包括光合、呼吸（分为植物呼吸和土壤呼吸）、蒸腾、荧光等多项测量功能，多项功能的完全集成使得LI-6400成为生态学研究领域上重要的必不可少的基础研究设备。为更好地服务于科学研究领域，以下主要针对LI-6400光合作用测定仪，从仪器功能与研究领域、使用技巧与注意事项等方面进行论述。

一、仪器功能与研究领域

（一）区域或全球性碳循环

碳循环主要包括植物对CO2的吸收固定、植物地上部呼吸、土壤和根系呼吸、CO2在大气中的流动等部分。

其中植物对CO2的吸收固定即指光合作用固定CO2，此方面在植物生理生态学上一直是研究的热点。这些方面的研究工作也比较成熟。LI-6400领先于传统开放系统的地方在于它将气体分析器安装于传感器头上。这样节省了气流到达传感器的时间，并且严格准确地反映出叶子的变化。例如，如气孔关闭，控制系统立即检测到水汽的变化并且进行平衡。同样地，光照的突然变化会导致光合速率的突然变化，这会由CO2浓度的变化来检测到。检测速度的改进不是依赖于气流计（传统系统往往这样），而是由于将样品IRGA安装于叶室内。将IRGA（红外线气体分析仪）安装于传感器头上还有一个优点，传统系统在气体由参比IRGA到叶室和从叶室进入样品IRGA时存在潜在的集聚滞后作用（由于水的吸收和二氧化碳的扩散），导致测量不准确。而LI-6400不存在这样的问题，因为IRGA测量的是已通过管道的气体。

植物地上部分的呼吸可以采用LI-6400的标准叶室来测量叶片的呼吸（包括光呼吸合暗呼吸，其中光呼吸部分有自动测量曲线来计算）、采用自定义的叶室来测量茎的呼吸。

土壤和根系呼吸主要包括土壤呼吸、根系呼吸、微生物呼吸。土壤呼吸是陆地生态系统碳循环的重要组成部分，土壤碳库的主要输出途径。研究意义涉及全球变化、土壤肥力与质量、光合碳源、群落结构、环境胁迫的响应等。近些年来应用6400-09土壤叶室进行土壤方面研究的工作较多（骆亦其，2001，nature）。

大气中CO2通量研究主要采用LI-COR公司生产的CO2/H2O分析仪系列仪器来测量，根据不同的研究需要和精度需要可选取不同的仪器。LI-7500开放路径CO2/H2O分析仪是一个绝对的非分散的红外气体分析仪。可用于对空气扰动结构下原位二氧化碳和水蒸气的绝对密度精确测量。这些数据与音速风速计测定的空气扰动数据结合可确定二氧化碳和水的通量变化。LI-7500具有高速, 高精确度, 低能消费和防风雨的电子学特性，主要应用于农业、林业、草地、沙漠和海洋等环境变化和生境的通量研究。

LI-7000是一个封闭路径、高性能、非扩散的红外线CO2/H2O分析仪，是在LI-COR其他气体分析仪器的多年经验基础上发展起来的。可用于绝对的或微差模式，或者作为两个单独的绝对CO2/H2O分析仪来使用。LI-7000适于应用于许多要求高速度、高精度的绝对的或微差模式的测量。包括：生长箱中的植物气体交换、Atmospheric-surface flux eddy covariance and Bowen ratio techniques、Vertical profiling、常规大气监测。LI-7000的一个重要特性是可测量水生样品中的溶解二氧化碳(pCO2)和总有机碳(TOC)。LI-7000内在的稳定性和广谱的操作温度范围，还适合于火山、地热、工业等恶劣环境的测量。另外它还应用于：环境监测、生物治疗、工业监测、温室应用、生长箱应用、昆虫学研究、土壤二氧化碳流量测量、光合作用和呼吸作用研究、植物生理学、海洋学研究等。此外尚有如LI-6262、LI-6252、LI-820等许多相关产品。

（二）胁迫环境下的植物生理生态反应

植物光合作用是将太阳能转换为化学能的过程，在光能的吸收、传递和转换过程中，叶绿体色素起着关键作用。受光激发的叶绿素所产生的荧光一直被用来作为研究光合作用机理的探针，尤其是近年来随着叶绿素荧光理论和测定技术的进步，大大推动了光合作用原初反应及其他有关光合机理的研究。目前，国际上对植物体内叶绿素荧光动力学的研究已形成热点，并在强光、高温、低温、干旱等逆境生理研究中得到广泛应用,取得令人可喜的成果。荧光动力学可以作为快速灵敏地检测植物对环境污染反应的有效手段，同时根据植物反应的方式和程度的不同，辨别不同植物、不同器官对污染物的敏感性，培育抗污染的植物品种。

LI-6400新推出的6400-40荧光叶室。可以利用同一台仪器同时进行光合作用和叶绿素荧光测量，从表观现象和光合原初反应机理探讨叶片的光合作用，可以深入研究植物的生理响应，已经受到研究人员越来越多的重视。必将在国内外植物生理学、生态学、农学等多领域的研究中发挥越来越重要的作用。

叶绿素荧光是研究植物光合作用的良好探针，由于其分析技术具有快速、灵敏和非破坏性等优点，近年来发展十分迅速。但目前尚有许多理论和技术问题需要深入探讨。今后一个时期研究的重点是：

1）进一步加强叶绿素荧光理论的研究；

2）改进和完善叶绿素荧光分析技术，LI6400-40是目前测量参数最全、性价比最高的荧光测定仪，同时在操作、自我诊断、实验结果的代表性等方面都具有其它仪器所无法比拟的优点，必将在植物生理学、生态学和农业科学等研究中得到越来越广泛的应用。

（三）群体光合

自定义叶室进行研究

单一叶片的植物光合作用代表性有限，因而群体光合作用的研究成为研究的热点。然而至今为止，仍然没有比较完善的研究工具，一般而言，此方面研究多采用气体分析仪来进行。LI-6400可以连接自定义叶室，允许对小植株植物进行冠层光合作用研究。其中叶面积的确定可以LI-3000A或LI-3100叶面积仪来确定。同时可以利用LAI-2000来测算大的植物群落的叶面积指数，以进一步计算整个群落的光合作用。

自定义叶室的流程设计

LI-6400可以根据参考气体与叶室气体H2O浓度差、气体流通、叶面积等参数计算蒸腾速率；根据参考气体H2O与叶室H2O浓度与蒸腾速率计算叶面水分总导度；又据此以叶片两面的气孔密度比率计算水分气孔导度即气孔导度（其倒数即为气孔阻力）；根据气孔水分导度、叶片两面气孔密度比率、叶面边界层阻力计算气孔对CO2的导度。故LI-6400能够测定的植物光合与水分生理指标有：净光合（呼吸）速率、蒸腾速率、总气孔导度、气孔导度或气孔阻力、胞间CO2浓度、叶面相对湿度等。因而LI-6400可以用于水分平衡的研究工作。进一步的精细研究可以采用LI-1600气孔计来测量植物叶片的气孔导度、蒸腾速率、相对湿度等指标。

二、使用技巧与注意事项

以下从LI-6400的电池、安装、运输、叶室垫片维护、自定义叶室等7个重要个方面做了阐述，希望对使用者有所帮助。

（一）关于LI-6400外接电池的注意事项

由于某些用户在野外使用LI-6400时，常常感到电池使用时间不够长，希望使用外接的大容量电池，对此，是完全可行的。但是，提请您注意一下几点：

1）我们仍然坚持推荐您使用原厂的原装电池。通常每两节原装电池充足电后，可使用二至三小时，如果用六节电池基本上可满足您日常测量的需要；

2）当您必须使用外接电池时，您可以使用12伏特的铅酸蓄电池，并请您安排妥当人员负责电池的连接，务必注意电源极性，切不可将正负极性接反，红色接正极，黑色接负极；

3) 请您在电池的正极务必增加一个10安培的保险，串接在回路中；

4) 请您使用原厂的镀金接头与机器连接，以增加可靠性；LICOR可提供此配件；

5) 注意，外接电池需使用对应的电池充电器，且充电后充电电压应当小于15.00伏；

（二）连接叶室与主机电缆的几个问题

 1) 您或您的学生使用LI-6400时，他（她）是否接受了正规的操作培训？否则将不能正常操作使用。

 2) 您连接电缆时，必须用固定螺丝固定电缆头；必须将红色标记对应后再固定到位；

 3) 在野外使用，接头处会经常藏有尘土，无论您插拔接头都会感到比平时有困难，您应经常清理接头部位的灰尘；

 4) 仪器使用结束时，您取下插头时，必须是正确持位，您必须用手拿住接头部位，不可拽线，以免线从接头出脱落；

（三）用户如何将自己制作的叶室连接到LI-6400分析器头部

在LI-6400的应用方面，用户能够非常容易的将自己制作的其它形状和大小的叶室连接到LI-6400传感器的头部，而且LI-6400能够适应各种不同气体交换的配置。用户自己在制作和设计叶室时，必须注意叶室的形状和体积。因为样本的形状和大小不仅影响着测量材料的大小和形状，而且还影响叶室中空气流量和参比室、样本室浓度差异的大小程度。在叶室体积增加以后，可能需要在叶室中安装一个风扇。

在正常田间条件下，LI-6400叶室中温度的控制范围为周围空气的温度±6OC。在较大叶室条件下，通过标准的热电偶制冷器而控制的温度的变化范围将会降低。

在叶室设计方面必须认真考虑叶室的材料和叶室材料对水蒸气的吸附作用/非吸附作用。在绝大部分类型的表面上，水蒸气倾向于缓慢地吸附和非吸附，并且需要很长的时间达到两者之间的平衡。为了使吸附作用/非吸附作用的效应最小化，可以利用聚四氟乙烯管固定叶室壁。

总之，LI-6400可以非常简单的应用在各种形式的测量上。从直径为1cm的拟南芥叶室到体积为1升的土壤呼吸叶室都可以在LI-COR公司订购。对在这两个大小之间的叶室，都可以通过相对简单的、通过利用6400-09的电镀固定盘或6400-05的电镀固定盘将大部分的以各种形式设计的叶室安装在IRGA的分析器头部，目的是增加叶室中可以容纳的植物材料数量，提高CO2交换速率较低情况下测量结果的精确度。

（四）采用粘贴方法解决一个棘手的问题

如果你曾经有如何将几个很小的草叶或针叶正确放置在气体交换测量的正确位置的困惑，下面提供了解决这个问题的一个技巧。

在安装一个新的垫圈后，利用一些额外的材料，剪下两个小的部分，大约0.4cm宽2.0cm长，并将它们粘贴在下面2.0cm长垫圈的任何一边。然后用双面胶覆盖这些材料。这些双面胶并不妨碍叶室上部的垫圈，因此我们仍然可以在叶室没有被粘住的情况下，正常的开关叶室，但是小的叶片或针叶仍然被粘贴在双面胶上并保持在测量的正确位置。借助粘性胶带的帮助，一些重叠的叶片也能够被展平并且保持不再重叠。
对那些更有劲的、不容易折短的植物材料，可以采用LI-COR公司生产的针叶固定配件（# 6400-34）。如果有什么问题，请和我们联系。

（五）叶室泡沫垫维护

叶室上的泡沫垫维护是很重要的。当不用时切勿锁闭叶室，因为如果叶室锁闭数小时，泡沫垫将处于压缩状态。黑色氮酊橡胶从这种状态一夜将能恢复，用于LED光源的白色泡沫垫则不能。泡沫垫更换叶室上2个泡沫垫和叶室泡沫垫后面的空气密封垫，视需要应全部更换。重要的是要正确撕下旧垫。垫片泡沫下方有一薄膜，它是不涂胶托片。用手指甲或者小刀的边缘，试撬起托片边缘。如果你只撬起泡沫和胶料，托片将留在叶室上，并且很难刮下。如果你从下面取托片，整个泡沫垫就很快取下。
往往在取下泡沫垫后，叶室上残留一些胶料。如果它是上了漆的金属叶室零件，可用丙酮或其它溶剂予以清洁。切勿在塑料针叶室上使用溶剂。

泡沫垫的更换是在取下不干胶贴纸后安装。当你取下贴纸时你看看有无胶料自粘结一起的沟槽。如果你稍许伸直垫片,沟槽就会消失。如果你使用有沟槽的换片,叶室会漏气。

（六）LI-6400装运

如果你需要把LI-6400放在装运箱内运输,我们建议你遵守下列提示：

闭合叶室，手把捆紧。

关闭叶室并用一片胶带或一电线捆紧,以防弹簧受载的手把开启。忘记做这项事可能导致手把内部的叶室抓杆弯曲或折断。当LED光源装于叶室时很有可能会发生该事故。一定要把锁紧调整旋钮设置到泡沫垫不被压缩。

主机装在箱内

主机装在箱内应：a）显示器朝上，面向箱子手把；b）主机手把置于箱体宽大的一面。这样有助于关闭箱盖，而把主机放在保护最好的方向。

（七）寻找漏气

漏气将引起CO2读数不稳定,你可能会首先怀疑IRGA有问题。

传感器头或主机漏气

如果参考室浓度显得稳定，而样本室浓度不稳定，这将提示传感器头某处漏气。如果两室都不稳定，则是主机漏气。如果参考室稳定，在紧闭的叶室做一下漏气试验。向叶室上部和周围吹口气，看样本CO2有无响应。在合适封闭的叶室中，CO2的增加量不会超过1或2ppm。靠近叶室垫片吹气，由于CO2经垫片扩散，一般有某些反应，但是这种反应会迟后并且很小。如果你发现CO2增量超过5或10μmol mol-1，那么漏气你必须排除。为了隔离漏气，你可通过小细管向选定的位置吹气。提示:查明6个O形密封环是否都处于正确位置（在叶室两半部和IRGA支管之间），清洁并稍加润滑。

主机漏气

气泵进气一边的任何漏气将导致环境空气吸入系统，因此在化学试剂管上吹气，或者向主机内吹气，在两个IRGA中经几秒钟后将迅速升高CO2浓度。（在CO2全被清净时本试验效果更好，因为你的任何呼气在进入正常空气入口后将被清净）。

碱石灰和干燥管

这两个管子是通常的漏气源。

1)碱石灰不良

2)碱石灰使用太久，开始引导某些周围CO2进入系统。

3)主机侧放，而不是竖直放

空气出入口O形密封圈

到主机的每个空气出入口管子周围都有一小的O形密封圈。它们都在吗?它们都清洁过并稍加润滑吗？化学试剂管在主机上封紧了吗？附件的螺钉不要上得太紧,没有专用工具别卸下。稍紧就可以了。

端盖O形密封圈

化学试剂管每个端盖上都有一大的O形密封，当端盖上紧时它应轻微压缩。如果有间隙，可能是由于螺纹积污所致。必要时用水清洁螺纹，并在每次更换化学试剂时保持清洁。

快速接头

在快速接头内部有一类似O形密封圈的橡胶封。当一管子插入快速接头时，在插入时遇到内部夹紧装置前比较容易；必须再推入约0.25“（0.5cm），使其与橡胶封接触。管口外形的变化都会使管子插入快速接头变得困难；在这种情况下，不合适的插入都会使管子松动并导致漏气。在插入管子时潮湿管端。快速接头上的红色弹簧是移出管子用的。在取出管子之前向快速接头中心方向压缩弹簧夹。如果你不压缩红色弹簧夹而很容易拔出管子，则表示管子没有插紧。在管子的末端遗留有夹紧沟的痕迹；如果该痕迹离末端1/4”，表明管子插进合适。

空气缓冲器

到空气缓冲器之一的1个联接有一个90°银色弯头配合和1个倒剌管头。在银色弯头中在弯头体和空气缓冲器之间有一内置的O形密封环,另一个密封环在弯头体的另一边,在弯头的下面,看来好像一个螺帽。

三、结语

以上为LI-COR的仪器的一些简介。其中LI-6400由于功能十分强大、复杂，非一篇文章所能概述，本文仅是简要介绍其功能和使用的部分重要方面，希望能对使用者有所帮助。

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