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gaoshandian1金虫 (小有名气)
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基因工程抗体
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自从1975年，Kohler和Milstein发现的杂交瘤技术以来， 单克隆抗体技术已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中。鼠杂 交瘤是单克隆抗体的第一个可靠来源，但是临床反复应用会导 致抗鼠免疫反应。临床上理想的抗体应该是完全人源化的。而 人源单抗的生产在技术上难以克服融合率低、建株难、不稳定、 产量低、人体不能随意免疫等问题。2O世纪8O年代中期，随着 基因工程技术的发展以及抗体分子遗传学的深入研究，应用基 因工程技术来改造现有优良的鼠单抗的基因，减少抗体中的鼠 源成分，尽量保留原有抗体的特异性，此技术主要是将免疫球 蛋白基因结构与功能同DNA重组技术有机结合起来。在基因 的水平上将免疫球蛋白分子进行重组后导入转染细胞后表达， 基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗 体。本文主要介绍基因工程抗体的进展情况及临床应用。 1 基因工程抗体的研究进展 1．1 完整抗体是将鼠源性单克隆抗体经基因克隆及DNA 重组技术改造。将其相当部分氨基酸序列为人源序列所取代， 以此来减少异源抗体的免疫原性，避免诱导产生人抗鼠抗体 (human anti mouse antib~y。HAMA)和过敏反应。从而利于体 内诊断及治疗使用。目前研究较多的是嵌合抗体和改型抗体。 1．1．1 嵌合抗体：将鼠单克隆抗体的可变区基因与人恒定区 基因连接成嵌合基因后，插入表达质粒，最后在转染细胞表达 所产生的嵌合抗体分子，称之为嵌合抗体(chimeric antibody)。 其中可变区具有结合抗原的功能，而恒定区则具有抗体效应功 能、免疫原性和种属特异性，这对肿瘤的免疫治疗是非常重要 的。嵌合抗体的Fc段可补充细胞毒效应分子功能 ，并可延长 抗体在血清中的半衰期。这种技术保留了完整的鼠单抗可变区 序列，其亲和力和特异性都得到了保证，但也保留了鼠可变区 的异源性，仍可能诱导产生HAMA。目前已研制出了很多嵌合 抗体，有些已进入I期临床阶段，主要用于恶性肿瘤的诊疗。 1．1．2 改型抗体：为了降低嵌合抗体的免疫原性，以利其在临 床上使用，在嵌合抗体的基础上又构建了改型抗体(reshaped antibdy，RAb)r 。改型抗体是指利用基因工程技术，将人抗体 可变区(V)中互补性决定基(Complementarity determinative re— gion。CDR)氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR序列，重构成既具 有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb 亦叫“重构抗体”，因其主要涉及CDR 的“移植”，又可称为 “CDR移植抗体(CDR grafting antibody)”。此种抗体可以使人 单抗获得鼠单抗的特异性并最大限度地减少鼠单抗的免疫原 性。 1．2 小分子抗体 小分子抗体是利用重组DNA技术，通过细 菌表达决定抗体特异性的结构域所得到的，其大小只有完整 IgG分子的l／6～l／2，小分子抗体有分子量小、穿透性强、免疫 原性低，半衰期短，可在大肠杆菌等原核体系表达以及易于进 行基因工程操作等优点。目前研究较多或实用前景较明确的有 以下几种： 1．2．1 单链抗体：单链抗体(Single chain antibody，scFv)是将 重链可变区基因与轻链可变区基因用一寡聚核甘酸连接，在大 肠杆菌中表达成一单链多肽，并在细菌体内折叠成只由重链和 轻链可变区构成的一种新型的抗体，大小仅为完整IgG的U6， 与抗体分子相比，scFv在药代动力学上表现出了更好的组织穿 透力，用于治疗时就可进入一般抗体不能达到的部位。同时由 于抗原结合面不变，抗体片段拥有全部结合特异性。单链抗体 的独特之处在于其多肽接头，多肽接头可设计为具有特殊功能 的位点，如金属螫合、连接毒素或药物等，以用于影像和临床治 疗。单链抗体其优越性在于可通过包含体大量表达、易于基因 工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白，是目前研究最多的小 分子抗体。 1．2．2 双链抗体：通过化学或基因交叉连接Fab和scFv片 段，将其改造为二聚体复合物，其中最成功的设计就是通过缩 短单链抗体间的接头，使VHVL之间形成配对，形成的双链抗 体(diabody，60KD)，也可以运用此方法将scFv改造为三聚抗 体(90KD)、四聚抗体(120KD)口]。这类抗体比单链抗体在抗原 特异性识别和结合方面性能更好，在免疫诊疗方面前景十分广 阔。 1．2．3 Fab片段：将重链Fd基因与完整的轻链基因5’端接上 细菌的信号序列，所表达的蛋白在细菌信号肽的引导下可分泌 到周质腔，信号肽被信号肽酶所裂解，生成的Fd段和轻链在周 质腔中完成立体折叠和链内、链间二硫键，形成异二聚体，成为 有功能的Fab。这种小分子抗体具有抗体的活性，而大小为完 整IgG的I／3。另外，因其不含有Fc段、分子量小、免疫原性低， 故在肿瘤治疗上有其优越性。 1．2．4 单区抗体：根据抗体分子的结构，一般将Fv称作抗体 的最小单位，但有些更小的亚单位仍具有结合抗原的能力。如 单独重链可变区仍可保留与抗原结合的能力，而且保持了完整 抗体的特异性，称为单区抗体(Single domain antibody)，它的亲 和力低于完整的Fv。单区抗体大小只有完整IgG分子的1／12， 故更容易穿入细胞，到达完整抗体不能接近的部位。单区抗体 有望作为具有抗原特异性的基本单位，用来构建有效应功能和 结合亲合性的抗体。 1．3 多价抗体 传统的抗体只能结合单一特异性的抗原分 子，而多价抗体的多个抗原结合位点具有不同的特异性，能够 结合不同的抗原分子。研究较为深入的多价抗体是双特异性抗 体(bispecific antibody，BsAb)。此类抗体是将两个不同的结合 特异性片段融合在一起形成的，能分别与靶细胞和效应细胞结 合靶向杀灭肿瘤细胞。BsAb的研制经历了鼠源性单克隆抗体 的化学偶联、双杂交瘤和基因工程BsAb三个发展阶段，其中基 因工程BsAb的类型较多，它们与鼠源性BsAb相比具有较低 的免疫原性和较好的组织穿透力，有的已在产量和纯度方面达 到了l临床应用标准 ]。 1．4 抗体基因组文库 抗体库是近些年出现的一门新技术， 抗体库技术是指用基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变 区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表 达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因。 1989年，美国Scripps研究所Huse等首次报道了抗体组合库的 构建，其基本技术过程为：采用RT—PCR技术获得抗体基因，构 建抗体库，对库进行筛选，并在适当载体上表达。抗体库技术省 去了细胞融合步骤，省时省力；扩大了筛选容量，可在原核系统 中表达，生长迅速，成本低；因直接克隆到抗体基因，便于进一 步构建各种基因工程抗体；从根本上改变了单抗的制备流程， 在生物技术研究及开发中，成为众所瞩目的热点之一『5]。目前， 我国已建成迄今为止世界上第1个针对SARS的基因工程抗 体库。噬菌体抗体库技术是抗体库领域的最重要进展，它的出 现，推动了抗体基因组文库的发展。除此之外，还有mRNA一蛋 白质复合物库、细胞表面库、转基因鼠等技术方法，这些都大大 丰富了抗体库技术。 2 基因工程抗体的临床应用 近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续 问世，并在医学领域的许多方面都极具应用潜力，如病毒感染、 肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青 光眼治疗，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明 显。 2．1 在肿瘤性疾病诊疗方面的应用 放射性标记抗体在肿瘤 影像和治疗中很重要，并可有效进行药代动力学评估。以标记 抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称 放射免疫显像，由于基因工程抗体如单链抗体、Fab片段等分 子量小、能很快清除、组织穿透力强，所以更适于放射免疫显 像。例如，中等大小的双特异性抗体(60KD)与半衰期较短的同 位素相连，由于清除率快被用于临床影像学。治疗用的放射性 标记抗体如小抗体(90KD)，和半衰期较长的同位素相连，可在 肿瘤部位达到较高浓度，适合用于肿瘤治疗。2002年，美国 FDA批准了第一株用于肿瘤免疫治疗的放射性标记抗体(Ze— valin)上市 。 恶性肿瘤的导向治疗，是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原 的抗体与多种分子融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供 重要辅助功能。这些分子包括：放射性核素、细胞毒药物、毒素、 小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒。对肿瘤治疗来说，设计 的双特异性抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞 毒物质输送到肿瘤细胞。此外，抗体还可与携带药物的脂质体、 各种PEG偶联 ]，从而增强体内运输和药代动力学 ]。作为 免疫脂质体，转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大 脑 。抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗 。 2．2 基因工程抗体的抗感染作用 预防和治疗感染性疾病常 用的药物是疫苗和抗生素，但对于一些尚无有效预防及治疗手 段的感染性疾病如SARS、AIDS等，抗体治疗可做为首选方 案。如在治疗AIDS方面，利用抗体工程技术已成功地制备出 HIV 病毒整合菌的单链抗体ScAb2—19，对HIV病毒感染的早 期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为AIDS基因治疗的 有效手段。呼吸道合胞病毒(RSV)易引起婴儿呼吸道疾病，如 细支气管炎和肺炎，并可引起严重的并发症，目前已有人源化 单克隆抗体Pahvizumab经美国FDA批准上市，临床实验证明 无毒、副反应，并可显著降低婴儿的住院率 。我国率先建立了 针对SARS的基因工程抗体库，这对于SARS的预防、诊断和 治疗都将起到重要作用和深远影响。对于中和其它病原分子， FDA 已批准Fab单体分子作为抗蛇毒药物；scFv片段和寡克 隆复合物作为抗细菌毒素药物。 2．3 细胞内抗体 随着细胞信号转导和抗体工程技术的发 展，诞生了细胞内抗体技术。这项技术是指在细胞内表达并被 定位于亚细胞区室如胞核、胞浆或某些细胞器，与特定的靶分 子作用从而发挥生物学功能的一类新的工程抗体，最典型的是 scFv，被称为内抗体。胞内抗体技术主要应用在抑制病毒复制 特别是HIV一1复制、肿瘤基因治疗方面，现已逐渐拓展到中枢 神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域。体外培养 来源于无关供体的角质形成细胞同种移植物用于严重的烧伤 病人的治疗，往往会引起排斥反应，而MHC I类分子是引起移 植排斥的重要抗原。Mhashikar等用编码抗MHC I单链抗体的 腺病毒转染角质形成细胞，结果显示明显降低了MHC I的表 达，细胞内抗体介导的表型敲除是否有利于同种移植物的存活 还需要进一步研究。 2．1 用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术 生物传感器 和微阵列技术在不久以后将有可能成为主要的体外诊断技术。 对于大量诊断试剂盒，抗体有高敏感性和高特异性。从最初的 玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界面，用于诊断的抗体微矩阵 界面不断发展[1 。随着体外机械人的出现，这一技术将进一步 发展，并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。 3 展望 基因工程抗体的发展已使抗体制备技术进入了一个全新 的时代，此项技术已广泛深入到生物医学中的许多领域，不仅 可用于戒毒、血液性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、器官 移植、肿瘤、中毒性疾病、变态反应性疾病等方面的诊疗，而且 在蛋白质纯化工程中也有广阔的应用前景。随着分子生物学和 免疫学技术的不断发展，基因工程抗体势必将会对人类的生 产、生活起到更大的促进作用。 |
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