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无菌检查验证范例（中检所）
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*****注射液无菌检查的方法验证 1. 样品：*****注射液由******有限公司提供，批号。 2. 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号040203；霉菌液体培养基，批号040302； 营养肉汤培养基，批号0403045；营养琼脂培养基，批号040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；由中检所所培养基室提供。 3. 方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜过滤法方法验证 4. 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。 5. 菌液制备： 取经34℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7约为50～100cfu/ml备用。 取经24℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5约为50～100cfu/ml备用。 取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫已醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。 取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～100cfu/ml备用。 6. 供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30 ml溶解后，过滤。 7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。 表1 活菌计数（cfu/ml） 10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释 试验次数 1 2 1 2 1 2 金黄色葡萄球菌 56 60 枯草芽孢杆菌 77 79 白色念珠菌 86 70 黑曲霉菌 80 76 铜绿假单胞菌 47 50 8 方法验证 直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。 薄膜过滤法：取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37℃培养3～5d，逐日观察，结果见表1、2、3。 表2 *****注射液无菌检查法验证（直接接种法） 菌株 次数 管数 培养基 硫乙醇酸盐 霉菌 1 2 3 4 5 (d） 1 2 3 4 5 金黄色葡萄球菌 1 12 - - - - - - - - - - 2 1 2 - - - - - - - - - - 3 1 2 - - - - - - - - - - 白色念株菌 1 1 2 - + + + + - + + + + 2 12 - + + + + - + + + + 3 12 - + + + + - + + + + 枯草杆菌 1` 12 - - - - - - - - - - 2 12 - - - - - - - - - - 3 12 - - - - - - - - - - 黑曲霉 1 12 - + + + + - + + + + 2 12 - + + + + - + + + + 3 12 - + + + + - + + + + 铜绿假单胞菌 1 12 + + + + + + + + + + 2 12 + + + + + + + + + + 3 12 + + + + + + + + + + 生孢梭菌 1 12 + + + + + + + + + + 2 12 + + + + + + + + + + 3 12 + + + + + + + + + + 表3 薄膜过滤法人工污染金黄色葡萄球菌（活菌数58cfu） 硫乙醇酸盐液体培养基（100ml/滤器） 实验次数 培养1d 培养2d 培养3d 培养4d 培养5d 1（冲洗量500 ml） + + + + + 2（冲洗量500 ml） + + + + + 阴性对照（50 ml） - - - - - 表4 薄膜过滤法人工污染枯草杆菌（活菌数78cfu） 硫乙醇酸盐液体培养基（100ml/滤器） 实验次数 培养1d 培养2d 培养3d 培养4d 培养5d 1（冲洗量500 ml） + + + + + 2（冲洗量500 ml） + + + + + 阴性对照（50 ml） - - - - - 9 结论：根据上述结果，由于采用直接接种法进行****注射液的无菌检查，存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，****注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。 |
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