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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR求助
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kxxin66

金虫 (小有名气)
Biohydrogen(金币+1): 2010-10-05 15:05:30
我也遇到过这种情况，可以说是百分百假阳性，提质粒鉴定也是一样的结果。
本人认为点样孔的亮带是菌体的基因组影响的，100bp处一般会出现大片的引物二聚体。
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11楼2010-10-05 09:49:44
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shaoxinchen

铁杆木虫 (著名写手)
Biohydrogen(金币+1): 2010-10-05 15:05:40
原因可能有几点：
（1） 挑取的菌落太多，菌体裂解后产生的蛋白和多糖影响结果；
（2） 假如的菌液量太大，影响了PCR效果；
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同样的归宿，不同的人生！
12楼2010-10-05 12:03:42
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)

Always Keep The Faith！
Biohydrogen(金币+1): 2010-10-06 15:41:14
我做菌落PCR很少出现假阳性。PCR时我一般取1.5微升菌液（单菌落在4ml LB摇12hr）作为模板，25微升体系。
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物必先腐而后虫生
13楼2010-10-05 21:07:59
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我本兽医

铁虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
Originally posted by 米菲的旋律 at 2010-10-05 21:07:59:
我做菌落PCR很少出现假阳性。PCR时我一般取1.5微升菌液（单菌落在4ml LB摇12hr）作为模板，25微升体系。

同学，我不是故意掘你啊，1.5的模板，有点多
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14楼2010-10-07 08:45:14
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
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Clony PCR假阳性多的原因不是因为这种方法本身的问题，是你的引物特异性不够。我从来没有一次出现过假阳性的。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
15楼2010-10-07 08:49:49
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181587941

金虫 (正式写手)

你的什么菌啊？

★
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有些菌是很难破壁的，比如高温放线菌，我以前做过，因为破壁很困难，所以做菌落pcr也失败。
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16楼2010-10-07 12:20:49
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Biohydrogen

金虫 (正式写手)
感谢大家的回复, 我做的是革兰氏阴性菌,GC含量大概在60%. 开始用的是takara 的Taq聚合酶，外加10%或者15%的甘油，就出现上述情况，用提取的DNA也是有时能扩增有时不能。后来我改用他们家的PrimeSTAR，用GC buffer后每次都能扩增出来。我的PCR程序是：菌落摇过夜后取0.5微升做模板，聚合酶0.3微升，引物5pmol dNTP 2微升 2.5mM，25微升体系
然后95度3min变性， 循环中是95度30s，然后63度退火30s，然后72度扩增3min，做30个循环，然后是72度扩增10min。现在每次都能得到很好的结果（3kb）。
看来酶的影响也很大，以前用的是NEB的Taq，自己加甘油就能扩增好的条带出来，takara的好像则不行，不过这次买的他们家的primeSTAR倒是不错，每次产量也好，只是根据他说的错配率，不敢用它当pfu用，虽然他宣称是pfu，但是又说错配率在10的-4到-5左右，感觉和taq差不多，而NEB的pfu错配率则号称在10的-7次方，不知道大家怎么看这个问题。
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17楼2010-10-07 13:30:09
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)

Always Keep The Faith！
★
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引用回帖:
Originally posted by Biohydrogen at 2010-10-07 13:30:09:
感谢大家的回复, 我做的是革兰氏阴性菌,GC含量大概在60%. 开始用的是takara 的Taq聚合酶，外加10%或者15%的甘油，就出现上述情况，用提取的DNA也是有时能扩增有时不能。后来我改用他们家的PrimeSTAR，用GC buffer ...

我是把takara 的 pyrobest和primestar当做是pfu用的，扩增效率高，保真度可以达到定点突变的要求啊。primestar则用来扩增高GC含量的片段，效果没话说。
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物必先腐而后虫生
18楼2010-10-07 15:50:48
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yaushz

木虫 (正式写手)
★ ★
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silicare(金币+1):谢谢参与 2010-10-08 11:43:08
我做菌落PCR时从来都是挑菌后先在LB中晃一下，然后在预置好的PCR混合液中抽吸几次，最后加上Taq酶。PCR后，产物我会用胶跑两次，两次结果一致才可以。首先你要保证你配的胶是完全融化了的，反正加热的时候多观察一下，如果胶融不完全，条带跑的就怪异的很，我刚开始做实验就是这样。菌落PCR有假条带，结果观察要小心。
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19楼2010-10-07 16:02:35
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Biohydrogen

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 米菲的旋律 at 2010-10-07 15:50:48:


我是把takara 的 pyrobest和primestar当做是pfu用的，扩增效率高，保真度可以达到定点突变的要求啊。primestar则用来扩增高GC含量的片段，效果没话说。

恩,如果是这样的话,下次不妨尝试一下,毕竟比NEB的要便宜不少. 多谢了!
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20楼2010-10-08 11:20:56
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