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gaoshandian1金虫 (小有名气)
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不同的途径：通过染色质重塑调节V(D)J重组
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郝文慧 译 新乡医学院免疫学研究中心 河南新乡 453003 脊椎动物免疫系统应答各种抗原的能力依赖于淋巴细胞分化过程中，编码抗原受体蛋白TCR和Ig基因的程序性重排。部分受体的抗原结合区是由分离的编码V,D,J基因的片断组合而成。生物化学研究显示重组酶发挥作用主要依赖于RAG-1和RAG-2蛋白并至少再加一个辅助蛋白（HMG1或HMG2）协同作用。重组酶结合到邻近V,D,J编码片断的重组信号序列（RSS），产生一对适当的DNA片断并一起形成突出复合体，然后诱导RSS和它的邻近编码片断之间发生准确的双链断裂。断裂端再结合到含有双链断裂修复因子的重组体上。 可及性假说 发育中的淋巴细胞含有七个复杂的免疫受体基因座（4TCR和3Ig），他们的重排依赖于共同的重组酶。然而，TCR基因重排只存在于T细胞，Ig基因重排只存在于B细胞。另外，重组可以被临时调节：特异的基因座（如Ig重链基因座）在分化早期发生重排，然而其它基因座重排发生在细胞成熟时。在许多基因座，有效的重排只能发生在一个等位基因（称为等位基因排斥现象），这更进一步限制了重排基因片断的选择。在这些不同的细胞中，重组酶是怎样在恰当的时间而且只在一个等位基因内准确结合到适当的RSS上？同时，它是如何阻止错误的基因座在错误的时间或错误的细胞内重排？ 如此严密控制重组位点选择的方法是通过差别调节重组酶对TCR和Ig基因座的可及性。这种"可及性假说"是15年前由Alt和他的同事提出来的，假设将TCR和Ig基因座包装到染色质不同于T细胞和B细胞，而且这种包装根据基因座活性的不同而改变。与这种假说相一致，有效地V(D)J重组与转录增强有关，与DNA甲基化作用以及DNase对重排基因座的敏感性增强都有关，所有的这些都是染色质改变的标志。 图1：V(D)J重组 重组酶通过重组信号序列（RSS；三角形）作用于V，D和J编码片断（矩形），RSS由保守的七聚体和九聚体组成，二者又被12或23碱基对的间隔序列分离。有效的重组需要12-RSS（白色）/23-RSS（红色）配对。一旦RAG蛋白（椭圆）结合，12/23RSS对一起形成一个突触复合体。接着DNA裂解，产生量对末端：编码端和信号端。这些断裂的DNA中间体在双链断裂修复结构的参与下被连接从而产生编码和信号连接产物。 转录 由染色质组成的重复单位称为核小体，它们被逐渐依次折叠为更高一级的结构。每个核小体包括四个核心组蛋白（H2A,H2B,H3和H4）各两分子和围绕在组蛋白八聚体外的147bpDNA。第五个组蛋白H1结合到核小体核心外和两个核心之间的连接DNA上。核心组蛋白或邻近核小体之间的连接组蛋白的相互作用有利于更高一级的染色质包装。 单个核小体和进一步的折叠结构限制了反式作用因子结合到DNA上。在转录背景下，对这些局限性已做了深入研究。环绕组蛋白八聚体的DNA畸变会阻止因子结合，而且组蛋白自身可以在空间上阻碍DNA和其他蛋白的相互作用。紧密的染色质纤维利DNA序列的进一步包藏可以使它们相对于基因表达调节子和基本的转录蛋白"隐形"。有时核小体的策略安置有助于集合序列以增强因子结合，但是大多时候，染色质抑制转录。 至少有两个主要的染色质重塑系统被用来克服染色质抑制转录。一个是以Swi/Snf和相关的复合物为典型，是多亚基的具有ATP依赖性的重塑活性。在核小体中，这些复合物采用一种迄今还未确定的方法改变DNA和组蛋白的接触从而也影响核小体的定位。第二种染色质重塑模式涉及组蛋白的转录后修饰，包括乙酰化，磷酸化，和甲基化作用。这些修饰作用主要发生在核心组蛋白的氨基末端尾部区域，包括改变核小体内DNA和组蛋白的接触，核小体之间组蛋白和组蛋白的接触，以及组蛋白和其它蛋白之间的作用。这些修饰作用可以一起在任何水平"打开"染色质。在过去的几年，由于一些组蛋白修饰酶的确认，染色质重塑对基因表达调节的重要性已非常清楚。尤其，与转录激活相关的组蛋白乙酰转移酶可增强组蛋白的乙酰化作用，反之，与转录抑制相关的组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）可引起乙酰化作用降低。这些酶可以分别作为辅激活物或辅阻遏物发挥功能。它们不直接与DNA结合而是通过特定的序列，即DNA结合活化或抑制蛋白相互 作用从而被带到启动子区域。在转录调节上的染色质调整为V(D)J重组的可及性问题提供了新的观点。在这两个过程中，一个根本问题是在适当的时间和适当的细胞中染色质怎样被修改。对于转录，许多情况显示有效性，可以最终反映过程的逐步改变。例如，球蛋白基因座活化时，非靶的染色质重塑酶为启动子结合到它们的靶位点提供机会。然后这些增强子结合元件能够募集另外的染色质重塑活性去激活特定的启动子。靶结合的Swi/Snf或HAT复合物一般可以改变邻近它们募集位点的有限的染色质区域，促进另外的转录因子结合并最终募集RNA聚合酶。Swi/Snf和HAT复合物在调节一些基因时相继发挥作用。例如，在酵母里通过Swi5募集Swi/Snf到HO启动子是募集SAGA HAT复合物的必要条件。SAGA的募集导致大约1kb的区域去乙酰化，从而结合另外的反式作用因子，如SBF,并促进转录。在这种情况下，主要通过启动蛋白的结合控制染色质重塑，这可以通过它们的表达周期或应答特定信号通路的活化来依次被控制。当然自身的重塑活性也可以应答细胞信号，提供其它层次的调节。相对于重排的染色质重塑可以按相似的路线进行，最终影响RSS个体的暴露或隔绝。 体外单个核小体抑制RSS的分裂 染色质确实限制VDJ重组吗？体外VDJ分裂测定的发展已可以检测核小体对重排初步的作用。将纯化的RAG-1和RAG-2蛋白与非特异性的DNA结合蛋白HMG1或HMG2共孵育，在适当的二价金属离子存在时，能够有效分裂含有RSS的底物。利用缺乏实质蛋白RAG-1和RAG-2中心轴缩短的蛋白模式，因为这些蛋白比全长蛋白模式更好溶解。用这种方法，三个团体分别独立发现在这种染色质背景下RSS的分裂受到严重抑制。这种抑制主要出现在RAG结合水平，即使在RAG结合时位于核小体二联体附近的RSS分裂仍能阻断。因此，当转录时，核小体个体对V(D)J重组机制设置了很大的障碍。 组蛋白乙酰化和VDJ重组 因为组蛋白乙酰化在调节转录因子进入染色质时发挥主要作用，那么是否组蛋白也可以调节重组事件。McMurry和Krangel做的一系列实验证明伴随特定的V(D)J重组事件的组蛋白H3乙酰化出现改变。指责些研究者研究出一系列转基因小鼠，包括含有非重排Vδ,Dδ，Jδ，和Cδ基因片段连同野生型或突变增强子序列。在野生型增强子存在时发生完整的V(D)J重组，如果增强子删除或突变，就只发生V到D的重排，用对乙酰化的H3亚型特异的抗体做染色质免疫沉淀分析发现H3高乙酰化与由增强子序列驱动的完整V(D)J重组紧密连锁，内源性TCRα/δ基因座的分析也显示由增强子（Eδ和Eα）序列驱动的H3乙酰化发生了大范围的改变。McMurry和Krangel用重排缺陷的无RAG2的小鼠证明H3乙酰化的改变本质上是重排的上游区，这表明染色质修饰根本上是对这些基因座的RSS可及性的调节。 与这些发现相一致的，McBlane和Boyes发现在前B细胞通过化学抑制HDAC活性增加组蛋白乙酰化可以增强V(D)J重组。更重要的地，重组事件细胞和阶段特异性的保持表明组蛋白乙酰化的整体增加不增加所有位点的可及性而且其它因子对染色质打开有作用。 图2;染色质重塑和V(D)J重组 DNA折叠到染色质预示着可以在多重水平限制RAG蛋白到信号重组序列（RSS）。在这个模型，高浓缩的中间结构事实上可以使这些序列相对于重组结构隐形。ATP依赖的重塑活性如Swi/Snf和组蛋白修饰活性中的HATs触发更高一级结构的展开从而促进RAG的进入。一些RSS存在于核小体内而其它一些存在于展开结构的核小体之间的连接区域，因此染色质重塑活性也需要改变单个核小体的结构和位置 。RSS变得对分裂易感，而这种分裂存在于经Swi/Snf重塑的核小体里和无核小体区。在那些重塑活性可以使其更易接近的位点中，可能还有另外的机制控制重组位点的选择。 在体内这些结果大不相同，两个团体发现在体外核小体个体中的组蛋白高乙酰化不促进RSS分裂。有一个团体最近报道只在HMG1存在时乙酰化的单个核小体的分裂增强。，通过胰蛋白酶消化去除组蛋白尾部可以增加分裂的发现支持这种观点，即在单个核小体组蛋白有限制RSS分裂的作用。 体外实验观察到在单个核小体组蛋白乙酰化对RSS分裂作用的不同可以或不可以与体内实验相关，应考虑McMurry和Krange观察到的对H3乙酰化的大范围作用。如此大范围的改变可能反映了组蛋白乙酰化对更高一级染色质结构的作用，这也可以成为重组的主要障碍。乙酰化改变了组蛋白尾部的结构和电荷，在体外引起核小体解折叠的改变在体内可能改变邻近核粒子之间的作用。 当它们有能力转录时组蛋白乙酰化作用跨过整个结构域广泛增加（如球蛋白基因座），一旦重组活化出现类似的情形便可观察到大部分区域的高度乙酰化。球蛋白结构域的开放需要一个基因座控制区（LCR），这就出现一个问题是否存在重组的LCRs。重组基因座的大范围乙酰化需要增强子序列与这种可能性相一致，因为LCRs由多个增强子元件组成。如果重组存在LCRs，那么以后的重要任务就是鉴定结合这些元件的因子从而比较细胞和阶段特异性。 值得注意的是HATs可以乙酰化非组蛋白。当前无论RAG-1还是RAG-2在体内乙酰化都是未知的，但是这种修饰可以影响这些蛋白的活性或它们的亚细胞定位。 在单个核小体中Swi/Snf调节RSS对分裂的可及性 其它的染色质重塑活性可能也对V(D)J重组很重要。例如，类似Swi/Snf的活性通过改变DNA和组蛋白的接触或核小体相对于个别RSS的位置可以克服核小体对V(D)J重组的限制性。事实上，Kwon等人报道Swi/Snf引起的单个核小体稳定修饰在体外能增强RSS分裂。正如预想的，这种增强是ATP依赖性的；有趣的是它也需要HMG1.一个RSS集合到核小体二联体仍拒绝分裂，然而Swi/Snf可以增强其它的RSS在类似的核小体位点分裂。这些发现表明，至少在体外Swi/Snf重塑对增加重组结构对RSS的可及性不是普遍有效。 既然Swi/Snf和HATs如SAGA在一些基因的转录激活中一起发挥作用，Kwon等人测试了在单个核小体中Swi/Snf和组蛋白乙酰化对RSS分裂的共同作用。他们发现Swi/Snf和组蛋白乙酰化发挥作用一致增加RSS分裂，这表明两种重塑事件都对V(D)J重组的调节有作用。 RAG蛋白在可及性调节中的作用 上述讨论表明重组酶发挥消极作用，它在染色质结构支配下进入重组位点的能力由其它因子决定。然而我们不能排除这种可能性，即RAG蛋白在识别被包装到特定染色质结构中的底物或与特定范式作用因子有关的底物时发挥更多的积极作用。尽管RAG-2的羧基端对人工底物的重组和Ig重链DH到JH的重排是非必要的，但对VH到DJH的重排是特别需要的。而且，最近的研究表明氨基端缩短的RAG-1突变体能催化TCR基因重排但不能催化Ig基因重排。这些观察表明重组酶的特定结构域积极参与决定它对特定基因座的可及性。尽管这种作用的机制仍不清楚，有一种可能性是RAG-2的羧基端结构域与染色质重塑因子积极相关。 染色质对DNA修复的影响 人们普遍支持基因座可及性控制V(D)J重组分裂这一步的观点。然而最近的研究表明连接这一步也受到影响。Schlissel,Ferrier和同事们分析了TCRβ增强子缺陷小鼠的V(D)J重组。他们发现在TCRβ基因座RAG介导的分裂适度受损，与可及性降低一致。令人惊讶的是，断裂的DNA重组中间体，尤其是编码末端的连接显著减少，表明增强子在连接反应中发挥作用。也许增强子帮助募集适当处理断裂DNA中间体的DNA修复因子。这种作用通过染色质结构的局部修饰直接或间接的介导。 最近的实验观察到在DNA损害的几分钟内发生组蛋白H2A高度保守的变异体H2A.X尾部的氨基酸磷酸化，由此可以推测染色质改变和DNA修复之间有联系。这种磷酸化对募集DSB修复结构到损害位点很关键。特定组蛋白变异体的转录后修饰对邻近DSB的染色质整体结构修复和改变以及结合修复因子所需信号非常重要，而且这对V(D)J重组的连接相很重要。 将来的问题 在染色质重塑对转录的重要性已知的情况下，染色质对V(D)J重组的作用并不令人惊讶。事实上，染色质很可能影响利用DNA作为底物的全部过程。我们现在知道大多数染色质基本的元件，核小体在体外可以限制重组而染色质重塑活性至少可以部分克服这个障碍。我们也清楚在体内重组活化伴随着组蛋白乙酰化的改变。我们仍然存在很多问题，如重塑活性如何在准确的时间被募集到准确的重组位点，准确的细胞，。以后研究的焦点无疑是鉴定与这些活性靶结合的因子，以及与重组启动相关的染色质开放的动力学。是否转录自身与重组的染色质开放有关仍是一个重要的问题。另外，一旦有效的重组发生，鉴定染色质如何在非有效位点关闭对我们总体理解V(D)J重组调节和染色质重塑事件非常关键。 －－－－－－－－－－－－－－－ Cell 全文下载 |
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2楼2006-05-11 09:19:38