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【求助】免疫沉淀的问题 已有1人参与
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| 免疫沉淀实验，最后一次洗涤，去除上清，加入电泳上样缓冲液，95-100°C煮沸5分钟（将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来）。离心后取上清，弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80°C保存。我想问的是得到的上清进行WB分析时，这个上清是目的抗原？还是抗原抗体复合物？在做WB的时候需不需要再加目的蛋白的抗体？ |
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jinchanzi
木虫 (小有名气)
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| 珠子蛋白A/G-抗体-目的蛋白之间的结合是这样的，抗体和目的蛋白以及蛋白A/G之间是以非共价键结合的，只有proteinA/G与agrose-beads 是共价键结合的，因此在加电泳上样缓冲液中煮沸后，离心除去珠子，上清中只有目的蛋白，抗体，和一些非特异性蛋白。这样SDS-PAGE跑胶就有抗体和目的蛋白，抗体由于有重链和清莲之分，缓冲液中的巯基乙醇导致抗体的重链和轻链分开，从而使抗体分子变成重链分子（55KD）和轻链分子（25KD），如果所使用的二抗属于同一种属的话，WB结果中还能检测到重链和轻链分子，希望目的蛋白的分子量不要和重链轻链相近，否则不好分析到底是谁 |
2楼2011-04-24 10:20:53