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细菌耐药机制与临床治疗对策
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细菌耐药机制与临床治疗对策 细菌对抗菌药物的耐药性是自然界的抗生现象。每一种抗菌药物进入临床后伴随而来的是细菌的耐药，即细菌在药物高于人类接受的治疗剂量浓度下能生长繁殖。这种耐药可能与整个种的固有特性有关，也可能出现在正常敏感菌种内，通过变异或者基因转移获得。耐药基因决定了各种各样的机制，使细菌抵抗特定抗菌药物的抑制作用。 一、细菌耐药机制 细菌主要通过四种方式抵制抗菌药物作用，产生灭活酶或钝化酶，使抗菌药物失活或结构改变；抗菌药物作用靶位改变或数目改变，使之不与抗菌药物结合；改变细菌细胞壁的通透性，使之不能进入菌体内；通过主动外排作用，将药物排出菌体之外。另外，细菌分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包绕形成而细菌生物被膜，也是导致耐药的原因之一。这些耐药机制不是相互孤立存在的，两个或更多种不同的机制相互作用决定一种细菌对一种抗菌药物的耐药水平。 （一）细菌产生灭活酶或钝化酶 细菌可产生灭活酶或钝化酶，并以此来破坏各种抗菌药物。目前，细菌产生的灭活酶或钝化酶主要是β-内酰胺酶、氨基糖苷类抗菌药物钝化酶、氯霉素乙酰转移酶和MLS（大环内酯类—林克霉素类—链阳菌素类）类抗菌药物钝化酶，其中人们对β-内酰胺酶研究最为深入。 1、β-内酰胺酶： β-内酰胺酶根据各自的氨基酸序列可分为A、B、C、D共4种分子类别，按照各自的底物、抑制剂及分子结构分为4组，第1组是不被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸抑制的头孢菌素酶，分子量大于30kD，分子类别属C类。大部分由染色体介导，但近年来发现也可由质粒介导。第2组为可被克拉维酸抑制的β-内酰胺酶，为数量最多的一组，一半以上由质粒介导。根据对青霉素类、头孢菌素类、肟类β-内酰胺、氯唑西林、羧苄西林和碳青霉烯类抗菌药物的水解活性分为2a、2b、2be、2c、2d、2e共6个亚组；最近发现的不能被克拉维酸抑制的TEM型酶和染色体介导的A类碳青霉烯酶分属于2br和2f亚组。除2d的分子类别为D类外，其余各亚组分子类别均为A类。第3组酶的作用需要金属离子如Zn2+的参与，故称为金属β-内酰胺酶。分子类别属B类，不被克拉维酸抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制。第4组包括少量青霉素酶，不被克拉维酸抑制，主要由染色体介导。本组分子类别未知。 多数临床常见致病菌可产生β-内酰胺酶，由革兰阳性菌产生的β-内酰胺酶以葡萄球菌属产生的青霉素酶最重要，而在革兰阴性菌中，超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）愈来愈受到重视。第三代头孢菌素因为拥有氨基噻唑－甲氧氨基侧链来对抗导致早期对b－内酰胺类抗菌药物耐药的b－内酰胺酶，人们认为这些抗菌药物不可能与b－内酰胺酶的活性部位结合，将它们称为“超广谱b－内酰胺类抗菌药物” ，所以把能水解这些“超广谱b－内酰胺类抗菌药物”的b－内酰胺酶叫作“超广谱b－内酰胺酶”。超广谱b－内酰胺酶对甲氧亚氨基b－内酰胺类抗菌药物如头孢他啶、头孢噻肟以及单氨类抗菌药物如氨曲南等药物一种或多种耐药，主要由肠杆菌科细菌如肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌等细菌产生，ESBLs大部分由质粒介导，除TEM型及SHV型衍生的b－内酰胺酶以外，ESBLs还包括PER型酶、CTX型酶及K1、TOHO-1、 MEN-1、VEB-1等型酶。 近年来，在革兰阴性杆菌中高水平表达的染色体介导的AmpC酶已渐成为临床上面临的严重治疗问题。AmpC酶为不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶，可引起革兰阴性杆菌对第三代头孢菌素及单环类抗生素耐药。AmpC酶以诱导酶和非诱导酶存在于不同的细菌中，大部分肠杆菌属和铜绿假单胞菌拥有染色体介导的Class1b－内酰胺酶，阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、铜绿假单胞菌在缺乏b－内酰胺类抗生素时，只产生少量的b－内酰胺酶，当有诱导作用的b－内酰胺类抗生素存在时，b－内酰胺酶的产量明显增加，因而这类酶又叫诱导酶。AmpC酶的诱导具有菌种依赖性、诱导剂依赖性及诱导条件依赖性。酶诱导后增加的范围在100—1000倍之间。 AmpC酶的表达受amp复合操纵子调控，amp操纵子由4个不连锁酌因即ampC、ampR、ampD和ampG组成，ampC是AmpC酶的结构基因；ampR编码诱导性转录调控因子；ampD编码一种新的N—乙酰葡搪胺—L—丙氨酸酰胺酶；ampG编码膜结合转运蛋白；目前研究发现，AmpC酶出现由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移趋势，大大提高了AmpC酶的横向传播能力。 2、氨基糖苷类抗菌药物钝化酶 氨基糖苷类抗菌药物钝化酶可修饰抗菌药物分子中某些保持抗菌活性所必须的基团，使其与作用靶位核糖体的亲和力大为降低。这些钝化酶包括氨基糖苷酰基转移酶、氨基糖苷腺苷转移酶或氨基糖苷核苷转移酶和氨基糖苷磷酸转移酶等。 （二） 细菌药物作用靶位改变 1、β-内酰胺类抗菌药物作用靶位改变： β-内酰胺类是临床最常用的抗菌药物，其作用靶点是青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins,PBPs）。PBPs是一组位于细菌内膜、具有催化作用的酶，参与细菌细胞壁的合成、形态维持和细菌糖肽结构调整等功能。目前研究发现的由PBPs改变而引起的耐药细菌主要有葡萄球菌、肺炎链球菌以及铜绿假单胞菌、不动杆菌属、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏球菌等G-细菌。 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus ,MRSA)的耐药机制为产生PBP2a，其中PBP2a对β-内酰胺类药物亲和力很低，分子量为78kDa，当β-内酰胺类药物以共价结合的方式使正常的4种主要PBPs失活，PBP2a可替代完成细胞壁合成的功能，从而产生耐药。表皮葡萄球菌中也存在耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus epidermidis ,MRSE)，其耐药机制与MRSA相同。肺炎链球菌有6种PBPs，PBP1a/1b(100kDa)、PBP2a/2x/2b(95-78kDa)、PBP3(43kDa)。在耐青霉素肺炎链球菌(penicillin resistant streptococcus pneumoniae ,PRSP)中，PBP1a、2a、2x、2b对β-内酰胺类药物的亲和力下降。由于G-细菌的产酶耐药机制和通透性改变等耐药作用明显，PBPs在其耐药机制中的作用并不显要。实验室研究发现铜绿假单胞菌的PBP3，不动杆菌的PBP1、PBP2、PBP5，流感嗜血杆菌的PBP3、PBP4、PBP5，淋病奈瑟氏球菌的PBP1、PBP2，脑膜炎奈瑟氏球菌的PBP2与其耐β-内酰胺类抗菌药物有关。目前在其他G-细菌，如肠杆菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌属、变形杆菌属、沙雷菌属以及大肠埃希菌中，尚未发现与PBPs有关的耐药性。 2、万古霉素作用靶位改变： 万古霉素是一种高分子量的糖肽类抗菌药物，它和革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖前体五肽中的D-丙氨酸-D-丙氨酸末端（D-ala-D-ala）结合，抑制细菌细胞壁蛋白合成。绝大多数临床的革兰氏阳性菌，均对万古霉素敏感。万古霉素也是治疗MRSA临床感染的最为有效的抗菌药物。但因为临床上万古霉素的大量使用及其在使用中的不合理现象，导致了耐万古霉素肠球菌（vancomycin resistant enterococus ,VRE）的出现。VRE可通过DNA获得质粒或转座子以及突变株的发生，而产生耐药性。根据VRE在对万古霉素和替考拉宁耐药水平、可诱导性和可转移性上的差异，可以将已出现的VRE分为4种表型：VanA，VanB，VanC和VanD。其耐药机制主要与万古霉素结合靶位改变有关。如VanA，其耐药基因位于转座子Tnl546上，易于转移，并且伴随vanA基因编码生成多种功能蛋白，包括VanA、VanH、VanS、VanR、VanX、VanY，VanS是膜传感蛋白，可检测到环境中万古霉素的存在，探测到后，VanS就会向应答蛋白VanR发出信号，后者再激活与耐药功能相关的VanH、VanA、VanX的合成。VanH是一种产生D—乳酸的脱氢酶。VanA蛋白是D—乳酸：D—丙氨酸连接酶，它催化生成D-ala—D-lac二肽，代替了正常肽聚糖合成五肽前体中的D-ala—D-ala二肽。D-ala—D-lac在细胞自身染色体编码的酶的作用下与UDP-NAM三肽连接生成新的UDP-NAM五肽前体。万古霉素对该五肽的亲和力很低，无法再与之结合，从而细菌对万古霉素产生耐药。VanX蛋白则是存在于细胞质中的D，D—二肽酶，它解离已生成的D-ala—D-ala，而不水解D-ala—D-lac或含D-ala—D-lac的五肽前体，从而进一步阻止含D-ala—D-ala肽聚糖的正常前体的合成。如果有部分D-Ma—D-ala逃过了VanX蛋白的水解作用而合成了正常的肽聚糖前体五肽，那由 vanA基因簇编码产生VanY蛋白(羧肽酶)仍可以将正常的肽聚糖前体五肽的末端残基(如D-ala)解离，生成一种万古霉素不能与之结合的四肽，而产生对万古霉素耐药性。 3、大环内酯类、林可霉素、链阳菌素、四环素类、氨基糖苷类药物作用靶位改变： 此类药物主要通过与细菌核糖体结合，抑制细菌蛋白质合成，而发挥抗菌作用。细菌核糖体由大亚基（50s）、小亚基(30s)构成，亚基中mRNA及蛋白质的改变，可引起与抗菌药物亲和力的变化，而产生对上述几类药物的耐药性。 大环内酯耐药菌可合成甲基化酶，使位于核糖体50S亚单位的23SrRNA的腺嘌呤甲基化，导致抗菌药物不能与结合部位结合。因大环内酯类抗菌药物、林可霉素及链阳菌素的作用部位相仿，所以耐药菌对上述3类抗菌药物常同时耐药，称为MLS(macro1ide，lincosamide，streptogramins)耐药。此类耐药菌的耐药基因为位于质粒或染色体上的erm（erythromycin resistance methylase）基因，目前至少已发现8类erm基因，常见的有ermA、ermC(葡萄球菌属耐药基因)，ermAM(链球菌属耐药基因)。 细菌对四环素耐药的主要原因之一是，细菌产生基因tetM编码的6.8×103及7.5×103的可溶性蛋白，该蛋白与核糖体结合，保护核糖体或其他决定簇，从而阻止四环素对蛋白合成的抑制作用。该基因亦与多西环素、米诺环素耐药有关。 细菌对氨基糖苷类耐药的主要原因是细菌产生钝化酶，而有些细菌也可通过编码核糖体蛋白的基因突变导致核糖体结构改变，从而阻止细菌与抗菌药物的结合，如抗药结核分支杆菌、金葡菌、大肠埃希菌等对链霉素的耐药。 4、利福霉素类作用靶位改变： 利福霉素类通过与RNA聚合酶结合，抑制细菌转录过程，而到达抗菌效果。耐利福霉素细菌，如大肠埃希菌、结核分支杆菌，编码RNA聚合酶β亚基的基因（rpoB）可产生突变，导致其不易与利福霉素类药物相结合，而产生耐药。 5、喹诺酮类药物作用靶位改变： 喹诺酮可抑制DNA拓扑异构酶活性，阻止DNA复制、修复，染色体分离、转录及其他功能，从而发挥杀菌作用。DNA拓扑异构酶Ⅱ又常称为DNA旋转酶，其基因突变可引起耐药，以大肠埃希菌为显著。大肠埃希菌gryA基因序列上，残基67—106区域常发生突变，因而命名为喹诺酮类药物耐药区(QRDR)。gryA的改变产生耐药可能有两种解释，一种是由于酶结构的改变引起空间上的障碍，阻止喹诺酮进入喹诺酮作用区；另一种是由于物理、化学变化干扰喹诺酮-酶-DNA相互作用。每一种gryA突变都可造成对喹诺酮类中所有药物交叉耐药。因DAN旋转酶改变而对喹诺酮类抗菌药物产生耐药的细菌还有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠杆菌属和假单胞菌等。DNA拓扑异构酶Ⅳ的改变，产生对药物的低水平耐药。当拓扑异构酶Ⅱ、Ⅳ均发生变化，则耐药程度更大。 6、磺胺类药物作用靶位改变： 由于细菌不能使用外源性叶酸，磺胺类药物可通过抑制二氢叶酸合成酶或二氢叶酸还原酶，使细菌发生叶酸代谢障碍，而发挥抑菌作用。耐磺胺类药物的细菌的二氢叶酸合成酶或二氢叶酸还原酶与磺胺类药物亲和力降低，或靶位酶的合成量增加。 （三）细菌细胞膜渗透性改变 细菌细胞膜与细胞的细胞膜相似，是一种具有高度选择性的渗透性屏障。细胞外膜上的某些特殊蛋白，即膜孔蛋白（porin）是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性扩散通道。抗菌药物也可通过这些膜孔蛋白进入菌体内部，发挥效用。而某些细菌由于膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使某些抗菌药物不能进入菌体内部，产生所谓“内在性耐药”或称“固有性耐药”(intrinsicallyresistant)，即这种耐药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所致。如铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰氏阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1／100。 一些具有高渗透性外膜的对抗菌药物原来敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药性，如原来允许某种抗菌药物通过的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。此种耐药机制往往对抗菌药物特异性较差，具有多重耐药性，因此，相对来说，临床选择有效药物的难度更大。 |
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（四）细菌主动药物外排机制 药物外排系统的耐药机制的研究源于20世纪80年代关于大肠埃希氏菌对四环素耐药机制的研究，随后是金黄色葡萄球菌对镉耐受性机制的研究。细菌主动药物转运系统根据其超分子结构、机理和顺序的同源性等可以将其分为四类：第一类为主要易化(MF)家族；第二类为耐药小节分裂(RND)家族，它也包括转运钙离子、钴离子和镍离子的转运器；第三类为链霉素耐药或葡萄球菌多重耐药家族，它假定由四种转膜螺旋组成的小转运器；第四类为ABC(ATP-bindingcassette，ATP结合盒)转运器，它由两个转膜蛋白和两个ATP结合亚基或结构域组成。前三类主动泵出系统运行所需能量由氢离子药物反转运体逆转H+，形成H+浓度差而产生的势能所提供，而第四类利用ATP水解所释放的自由能排出细胞内有毒物质。 外排系统广泛存在于革兰阳性菌(如金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌等)、真菌及哺乳类细胞(如癌细胞)中，其与细菌外膜通透性改变在多重耐药中起重要作用，愈来愈受到研究者重视。 （五）细菌生物被膜的形成 细菌生物被膜是指细菌粘附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。细菌间的多糖蛋白复合物形成孔道维持细菌物质代谢。常见的形成细菌生物被膜的临床致病菌有铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌等。 细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生耐药性，其原因有（1）细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透。（2）吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解。（3）细菌生物被膜下细菌代谢低下，对抗菌药物不敏感。（4）生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用。 由细菌生物被膜引起的感染主要有两种，一种是生物医学材料相关感染，如导管、插管、生物材料移植物（心脏瓣膜、骨关节等）相关感染；另一种为细菌生物被膜疾病，如肺囊性纤维化、慢性骨髓炎等。 二、细菌耐药临床治疗对策 近年来，新抗菌药物开发研制速度的降低，而细菌耐药性常为不可逆，抗菌药物耐药性成为需要紧急采取行动的全球性问题，世界卫生组织制定了遏制抗菌药物耐药问题的全球发展战略，即减少耐药性问题对健康事业及其费用的影响、延长现存药物和鼓励发展新药物。 （一）合理选择抗菌药物 抗菌药物在医院、农场，甚至社区滥用是抗菌药物耐药的主要原因。不当的抗菌药物的使用对细菌产生筛选作用，使耐药菌株有更好的生存环境，导致耐药菌株的流行。因此应针对致病源，合理选择抗菌药物、制定个体化给药方案具有重要意义。 β-内酰胺类药物是临床应用最广泛抗菌药物，其耐药机制主要为细菌产生β-内酰胺酶或PBPs改变。对于由于产灭活酶或钝化酶，而出现耐药的细菌，可应用对酶有一定稳定作用的药物、联合应用酶抑制剂或换用其他敏感的抗菌药物。针对产生β-内酰胺酶的细菌，可应用相对能抵抗β-内酰胺酶水解作用的抗菌药物，如甲氧西林、苯唑西林等均能对抗金黄色葡萄球菌产生的青霉素酶，羧苄西林具有抗I型染色体介导产β-内酰胺酶铜绿假单胞菌活性。头霉素类抗菌药物如头孢西丁、头孢替坦、拉氧头孢、及四代头孢菌素头孢唑肟、碳青霉烯抗菌药物亚胺培南等均对超广谱β-内酰胺酶具有一定稳定性。另外，可联合使用β-内酰胺酶抑制剂杀灭多数产β-内酰胺酶的细菌，如棒酸、他唑巴坦、舒巴坦与β-内酰胺类抗菌药物联合制剂，哌拉西林/他唑巴坦、美洛西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢哌酮/他唑巴坦等。应用其他抗菌药物如氨基糖苷类、喹诺酮类药物治疗产β-内酰胺酶细菌感染也是行之有效的方法。对产AmpC酶的细菌，应用碳青霉烯抗菌药物亚胺培南有较好的疗效。在寻找、设计酶抑制剂从而恢复第3代头孢菌素等β-内酰胺类抗生素对产AmpC酶的细菌的抗菌活性上，发现β-内酰胺酶抑制剂除克拉维酸外，舒巴坦和三唑巴坦未表现出因诱导而产生的拮抗用，甚至发现三唑巴坦与哌拉西林联合使用可以抑制细菌高产AmpC酶的耐药。其次，关于氨曲南和氯唑西林对AmpC酶的抑制作用也有报道。高硼酸类化合物作为新型β-内酰胺酶抑制剂，可以大大提高与AmpC酶的亲和力，作为AmpC酶抑制剂有着广阔的应用前景。消除PBPs介导耐药性的方法是采用β-内酰胺类抗菌药物的混合物攻击不同的PBP，以达到杀伤细菌的目的，或换用其他抗菌药物，如应用万古霉素治疗MRSA、MRSE。 （二）细菌耐药性进行监测 临床抗菌药物的应用，在未确定致病源、药敏试验结果未明确之前，往往进行经验性用药，根据患者感染部位、症状、程度选择，推测可能的致病菌，进一步选择抗菌药物。因此对某一区域致病菌的耐药性进行监测，预计耐药细菌的流行状况，并及时通报给临床医务工作人员有重要意义。 （三）防止耐药基因播散 细菌对抗菌药物的耐药性可以是先天的或基因突变产生的，但引起耐药菌的流行主要是外源性获得耐药，如带有耐药基因的质粒或转座子在细菌间的传递。质粒可以通过结合、噬菌体转导、转化而在细菌间传播。复杂的含耐药基因转座子带有转位酶、溶解酶和他们的抑制物的基因，可以随机转位插入复制体或任一位置而导致细菌产生耐药性。因此，对于耐药细菌的感染，应注意严格执行消毒隔离制度，避免或减少医源性交叉感染。 （四）开发新的抗菌药物 防治耐药性细菌感染的积极方法是开发新的抗菌药物，开发研制新的高效、低毒、广谱的抗菌药物仍是抗菌药物研究的方向。对于由产生灭活酶或钝化酶而导致的耐药，目前的研究方向主要是开发新的稳定性高的药物及新的酶抑制剂；对于由细菌外排系统引起的耐药，可以克隆外排基因，提高阻遏蛋白水平，调控外排基因的表达，或者设计相应的阻断剂，封闭基因；或者开发临床有实用价值的能量抑制剂等。 参考文献 1. Azucena,-E; Mobashery,-S. Aminoglycoside-modifying enzymes: mechanisms of catalytic processes and inhibition. Drug-Resist-Updat. 2001 Apr; 4(2): 106-17 2. Jorgensen,-J-H .Global perspective on antimicrobial resistance in Haemophilus influenzae. J-Chemother. 1991 Jan; 3 Suppl 1: 155-7 3. Van-Bambeke,-F; Tulkens,-P-M .Macrolides: pharmacokinetics and pharmacodynamics. Int-J-Antimicrob-Agents. 2001; 18 Suppl 1: S17-23 4. Jorgensen,-J-H .Global perspective on antimicrobial resistance in Haemophilus influenzae. J-Chemother. 1991 Jan; 3 Suppl 1: 155-7 5. Dalhoff,-K .Worldwide guidelines for respiratory tract infections: community-acquired pneumonia. Int-J-Antimicrob-Agents. 2001; 18 Suppl 1: S39-44 6. Garau,-J .The clinical impact of macrolide resistance in pneumococcal respiratory infections. Int-J-Antimicrob-Agents. 2001; 18 Suppl 1: S33-8 7. Zhao,-X; Drlica,-K. Restricting the selection of antibiotic-resistant mutants: a general strategy derived from fluoroquinolone studies. Clin-Infect-Dis. 2001 Sep 15; 33 Suppl 3: S147-56 8. Bearden,-D-T; Danziger,-L-H. Mechanism of action of and resistance to quinolones. Pharmacotherapy. 2001 Oct; 21(10 Pt 2): 224S-232S |
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