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[交流] （已求助成功，谢谢）生物素标记的原理（能检测到的原理）？

生物素标记的原理（能检测到的原理）
我不清楚生物素标记的蛋白能被检测到的原因是什么？既无荧光又无同位素。
那位行家解释一下。太感谢了！！！

[ Last edited by Giggsliuy on 2006-5-8 at 10:52 ]

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1楼 2006-05-06 20:25:53

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wj_21cn

木虫 (正式写手)

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steincat(金币+1):多谢参与！～
Giggsliuy(金币+2):多谢！

生物素可以与亲和素、链霉亲和素结合非常紧密。
所以，生物素标记蛋白，可以用链霉亲和素标记的荧光或者二抗检测。
就是说，蛋白质标记生物素，链霉亲和素标记荧光或者二抗。
然后用链霉亲和素与生物素的高结合力来检测。

以下是网上找到的一些背景资料：

生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。

4.5.2 生物素(biotin，B)
　　生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄(α型)和肝组织(β型)，提取αβ两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244．31，分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。
　　利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用。近年来，应用活化长臂生物素(BCNHS)标记生物大分子，可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼(BHZ)及肼化生物素(BCHZ)。

4.5.3 亲合素 (avidin，A)
　　亲合素亦称抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白：等电点(pI)为10-10.5，含糖约l0％，分子量为68kDa。纯品为白色粉末，易溶于水，在pH9-13的溶液中性质保持稳定，耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用80℃加热2min，仍保持活性，特别是和生物素结合后十分稳定。但对强光和Fe2+比较敏感。亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka：105-11mol-1)至少高1万倍，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。

4.5.4 链霉亲合素 (streptavidin，SA)
　　SA是链霉菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产物。1L培养液中约含SA 10-60mg，主要通过α亚氨基生物素琼脂糖凝胶亲和层析法提纯。SA的分子量为65KDa，内4条序列相同的肽链组成。如同亲合素一样，一个SA分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数亦为1015/mol。SA的每条肽链含159个氨基酸残基，其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的含量比亲合素少，反之酸性氨基酸含量较多，因此SA是一种稍偏酸性的蛋白质，其pH为6.0，并且不带任何糖基。