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gaoshandian1

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[交流] 附录二原位杂交组织化学常用试剂及处理

附录二　原位杂交组织化学常用试剂及处理
　　一、杂交前准备
　　（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。
　　DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。
　　注意：①DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。
　　（二）载玻片的处理
　　组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：
　　（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。
　　（2）HCl处理法

　　（三）硅化
　　【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。
　　（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。
　　（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。
　　（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。
　　（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180℃烘烤4h过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。
　　附：2%DMDC

　　配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。
　　用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。
　　【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。　
　　本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃烧干。
　　【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法

　　【方法4】
　　（1）49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；
　　（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗；
　　（3）玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上，塑料器皿应于60℃烘烤过夜。
　　注意：DMDC有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。
　　（四）载片的包被（粘贴）
　　１．沾附剂
　　（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)
　　储备液（0～5%）
　　
　　按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装，-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。
　　工作液（0.01%）：

　　充分混合，静止待气泡消失。
　　（2）明胶液

　　配法：先称取明胶溶于500～800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。
　　2．多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）
　　（1）将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。
　　（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。
　　（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。
　　多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4℃或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。
　　（4）Vectabond粘附剂
　　该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：
　　标本（铺片、切片等）→丙酮（5min）→Vectabond试剂工作液（5min）→dH2O(2×5min)→干燥（温箱，数小时过夜）→用铝箔包好，室温备用。
　　注意：制备和保存过程中避免污染。
　　经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4℃可更长）。
　　（五）硅鱼精子DNA的制备
　　（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；
　　（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）；
　　（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置50℃15min助溶；
　　（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；
　　（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；
　　（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.0～7.5；
　　（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度（μg/ml）；
　　（8）制备好的DNA液储于-20℃备用，用前取出冻融后煮沸。
　　二、关于探针的标记
　　（一）cRNA探针的同位素标记
　　1．标记液（转录标记）

　　2．转录缓冲液

　　※：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。
　　3．标记终止液

　　4．标记探针水解液

　　先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60℃条件下反应。
　　5．探针水解时间

　　注：LO－探针初始长度（kb）
　　Lf－探针的终长度（kb）
　　K－0.11kb/min
　　6．探针水解终止液

　　每次加入充分混合，临用前配。
　　7．探针沉淀液

　　每次加入，充分混合，新鲜配制。
　　（二）寡聚核苷酸3’端标记（cRNA探针）
　　1．标记反应液

　　2．终止液：0.2mol/L EDTA
　　3.探针沉淀液

　　（三）cRNA探针非同位素标记（地高辛及生物素）
　　1．标记液

　　△：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP
　　※：为检测标记率而加。
　　2．转录标记终止液
　　（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法
　　（2）生物素标记终止液：

　　（四）DNA探针标记常用试剂的配制
　　（1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。
　　（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。
　　（3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分装，-20℃保存一年。
　　（4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。
　　（5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。
　　（6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L β-巯基乙醇；500μg/ml BSA。
　　（7）1×加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。
　　（8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。
　　（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。
　　（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45μm膜过滤，室温保存。
　　（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。
　　（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。
　　（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。
　　（14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。
　　（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。
　　（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。
　　（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。
　　（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20℃贮存。
　　（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na2•2H2O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。
　　（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。
　　（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。
　　（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。
　　（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。
　　

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