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gaoshandian1金虫 (小有名气)
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原位杂交组织化学常用试剂及处理4
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（四）DNA探针标记常用试剂的配制 （1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。 （2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。 （3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分装，-20℃保存一年。 （4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。 （5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。 （6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L β-巯基乙醇；500μg/ml BSA。 （7）1×加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。 （8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。 （9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。 （10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45μm膜过滤，室温保存。 （11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。 （12）20×SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。 （13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。 （14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。 （15）T4多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。 （16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。 （17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。 （18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20℃贮存。 （19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na2·2H2O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。 （20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。 （21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。 （22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。 （23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。 三、固定剂 进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：①能很好地保持组织细胞的状态；②对核酸无抽提、修饰及降解作用；③不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；⑥理化性质稳定、价格低廉。 1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA） 配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2×PBS※，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 注意：①配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；②加热时，温度不宜过高，常为60～65℃，否则，PFA降解失效；③配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。 附：固定液用PBS的配制： 配法：按上述比例称取试剂，溶于DEPC水（也可用蒸馏水加DEPC）500～800ml中，过滤后，加水定容至1000ml，高压灭菌。通常配制成10×PBS的储备液，2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。 除用DEPC水配制PFA外，也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.01～0.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事项同上。 4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定4～12h，载片固定时间在10～15min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。 2．甲醛 ①10%甲醛（Formaldehyde,FA） 量取二者充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。 ②10%福尔马林试剂： 较适于固定细胞。 ③10%中性福尔马林 市售甲醛 100ml Na2HPO4 4g NaH2PO4 6.5g DEPC水 ～1000ml 常用于石蜡样品切片的固定。 10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。 3．4%戊二醛效果较40%差。 4．0.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。 5．乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DNA时。 乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。 6．甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。 7．甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。 8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。 四、LB培养基 （一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基） 配制：取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H2O约500～800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高压灭20min。 （二）琼脂糖平板培养基 细菌培养用琼脂（或琼脂糖） 15g 液体培养基（如LB） ～1000ml 按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。 五、小量质粒提取主要液体 1．溶液Ⅰ 2．溶液Ⅱ 3．溶液Ⅲ（3mol/L醋酸钠） 加热溶解后，再用冰醋酸（约40ml）调pH至4.8，补足H2O至200ml。 六、杂交前处理 1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法： 精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。 （2）工作液（临用前配）： 取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。 （3）关于P-K缓冲液的配制： 称取上述试剂，充分混合即可。 ②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)： 先将Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。 ③0.5mol/L的EDTA： 称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。 2．甘氨酸 （1）1mol/L甘氨酸： 称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。 （2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）： 将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。 甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。 3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐 配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。 生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。 4．RNA酶溶液 取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。 临用前，取RNA酶A储备液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）. 5.0.2% 取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。 七、杂交用液 1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC） 通常配成10×，20×，50×的储备液，如下： 配制：先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH2O中，滴加10N的NaOH，将pH值调至7.0，补足ddH2O至1000ml，加入终浓度为0.1%～0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。 该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用5×的SSC以保持一定湿度。 2．Denhardt’s液 通常配成10×，50×或100×的储备液 配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddH2O中，定容至1000ml后，过滤后于-20℃保存备用。 该液用于配制杂交液及予杂交液等。 3．杂交液及予杂交液 ※：临用前加；△予杂交液不加 配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。 变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。 配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50℃，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.5～2μg/ml，DNA探针浓度为1μg/ml,此外，如使用35S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。 八、杂交后漂洗溶液 无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。 该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。 该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2×SSC，10%（0.1%）SDS洗脱。 主要是洗去残留的RNA，降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。 4．Dig标记探针杂交后处理液 用ddH2O溶液并定容至1000ml。 用ddH2O溶解并定容至1000ml。 配制同上。 左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。 九、原位杂交信号显示 目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。 1．A-B显影液 称取上述试剂，按配方分别溶于50ml ddH2O中，于显影前，在室温将两者（A液及B液）按1：1混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片放入显影液，于室温避光（可暗室）反应5～15min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的AB显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB显影液要求临用前配制，在显影时才将AB二液混合。否则，A液过久会产生黄色沉淀，增加背景。 AB液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。 2．DAB-H2O显色液 配制方法见附录一。 该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。 3．NBT-BCIP显色液 配制方法，详见附录一。 该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。 4．Kodak D-19显影液 配制：先将500ml水中加温50℃，按上述配方顺序加药，同时充分搅拌，每加一种药完全溶解后，再加另一种药品，否则，所配的显影液易产生混浊而效果差，最后补足水至1000ml充分混合，室温或4℃避光保存。最好包上纸。 该液用于放射自显影时的显影。 5．Kodak F-5定影液（酸性坚膜定影液） ※：28%醋酸为3份冰醋酸和8份水混合液。 配制：同Kodak D-19显影液。 |
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