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gaoshandian1金虫 (小有名气)
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原位杂交组织化学常用试剂及处理3
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（四）载片的包被（粘贴） １．沾附剂 （1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL) 储备液（0～5%） 按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装，-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。 工作液（0.01%）： 充分混合，静止待气泡消失。 （2）明胶液 配法：先称取明胶溶于500～800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。 2．多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同） （1）将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。 （2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。 （3）将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。 多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4℃或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。 （4）Vectabond粘附剂 该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序： 标本（铺片、切片等）→丙酮（5min）→Vectabond试剂工作液（5min）→dH2O(2×5min)→干燥（温箱，数小时过夜）→用铝箔包好，室温备用。 注意：制备和保存过程中避免污染。 经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4℃可更长）。 （五）硅鱼精子DNA的制备 （1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h； （2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）； （3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置50℃15min助溶； （4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状； （5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）； （6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.0～7.5； （7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度（μg/ml）； （8）制备好的DNA液储于-20℃备用，用前取出冻融后煮沸。 二、关于探针的标记 （一）cRNA探针的同位素标记 1．标记液（转录标记） 2．转录缓冲液 ※：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。 3．标记终止液 4．标记探针水解液 先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60℃条件下反应。 5．探针水解时间 注：LO－探针初始长度（kb） Lf－探针的终长度（kb） K－0.11kb/min 6．探针水解终止液 每次加入充分混合，临用前配。 7．探针沉淀液 每次加入，充分混合，新鲜配制。 （二）寡聚核苷酸3’端标记（cRNA探针） 1．标记反应液 2．终止液：0.2mol/L EDTA 3.探针沉淀液 |
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