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gaoshandian1金虫 (小有名气)
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[交流]
全血细胞培养染色技术常用试剂配制
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一、国内实验室应用试剂配制 （一）培养液 （1）RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节 pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。 （2）小牛血清商品：成都生物制品厂。 （3）植物凝集素（PHA）：自制或成品（重庆药检所）。 （4）pH调整液：5%NaHCO3溶液高压灭菌（8磅15min），0.1N稀盐酸液100ml。 （5）秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高压灭菌（8磅10min）。 （6）磷酸缓冲液：pH7.4。 磷酸氢二钠28.8g(H2O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。 （7）Giemsa染色液： Giemsa粉剂 1g 甘油 66ml 在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。 （二）固定液 （1）甲酸：冰乙酸3：1混合即用。 （2）PBS缓冲液配制： NaCl 16g Na2HPO4(12H2O) 5.65g KCl 0.4g KH2PO4 0.4g 加双蒸水至1000ml pH7.0。 取5%胰酶（生理盐水配制）1ml加入50ml PBS液中（最终浓度为0.025%），4℃冰箱待用。 二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990） 1．完全培养基 RPMI 76.0ml 胎牛血清 20.0ml 植物凝集素 2.0ml 抗生素/抗菌素溶液（100×） 1.0ml L-谷氨酰胺（100×） 1.0ml 2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine, 5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH2O中，0.2μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃储存，BudR要在柔光（弱光）下操作。 3．胸腺嘧啶（Thymidine,Thd） 按250μg/ml溶解于dH2O中，过滤后分装储存于-20℃。 4．Colcemid(Sigma) 5.0μg/ml溶于dH2O中，过滤后分装储存于-20℃。 5．KCl（0.75mol/L） 溶解560mg于100ml dH2O中，新鲜配制37℃保存。 6．固定剂 甲醇冰醋酸按3：1（V/V）混合即可，现用现配，置冰上待用。 7．缺口平移试剂盒（Amersham和BRL公司） 8．生物素7-dATP(BRL) 9.糖原（BRL） 10．RNA酶A（Sigma） （1）储备液 称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中，置沸水中煮10min，分装后储于-20℃。 （2）工作液 用储备液按1：100稀释。 11．20×SSC NaCl 175g 柠檬酸三钠 88g dH2O 1000ml 固定试剂溶解后，dH2O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。 12．杂交液（高深度，HMmix） 去离子甲酰胺 6.0ml 100×Denhardt’s液 1.0ml 50%硫酸葡聚糖 2.0ml 1%人或鲑精DNA※ 20×SSC ※：临用前加入，终浓度为100～200μg/ml。 该液为高浓度杂交液， 存于4℃。 13．PBT液 BSA 5% Triston X-100/(PBS) 0.1% 注：BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。 14．兔抗生物素（α-生物素）单克隆抗体 用PBT液1：100稀释。 该单抗现可从英国Dako公司购得。 15．金（10～20nm）标羊抗兔二抗 用PBT液1：50稀释。 16．银溶液（Janesen） 17.Hoedst 33258（Sigma） 储备液（100×） Hoedst染料 5mg 甲醇 10ml 工作液：用2×SSC 1：100稀释储备液。 |
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