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girlfisher金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】关于细菌定点突变技术
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目前正考虑做细菌的基因敲除，打算用定点同源重组技术进行。看了几天资料文献有些问题，请了解的战友帮忙解惑，谢谢！ 问题1：根据文献，在进行带有突变基因的自杀质粒的大肠杆菌接合进行等位基因结合后，在此时为了消除作为基因供体的大肠杆菌，采用受体耐受但供体不耐受的抗性物质来去除。这里受体细菌如果不存在任何抗性呢？难道先在受体细菌内转化一个抗性质粒？可是质粒的转化并非在所有细菌都可以做到。 问题2：采用自杀质粒进行定点基因敲除是否对于所有或绝大多数革兰氏阴性细菌对象都可以做到？ 问题3：我总结了一下用自杀质粒进行细菌基因敲除的一般步骤，大家看看是否正确：首先获得同源基因的序列并通过PCR获得变异序列（可通过在序列内插入一个抗性基因使其失活并带上抗性），然后把变异序列插入自杀质粒中并将质粒转入能够复制该质粒并能接合的大肠杆菌内，将大肠杆菌与受体细菌一定比例混合接合一定时间，采用受体耐受供体不耐受的抗生素除去供体大肠杆菌，最后通过抗性平板或者PCR筛选鉴定阳性受体菌克隆。 |
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