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shich68

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[交流] 定量病理学技术在大肠癌研究中的应用进展

摘要定量病理学是用各种手段和分析方法在定性研究的基础上进一步从量化角度阐明疾病的病因、发病机理、发生发展规律及病变形态、机能和代谢特征的一门科学，是传统病理学科的进一步发展、完善和补充[1]。近来定量病理学应用于大肠癌的研究取得了很大进展，成为大肠癌研究的重要领域之一。本文就形态结构定量、DNA定量、核仁组成区相关嗜银蛋白（AgNORs）定量、分子病理学定量、免疫组化定量及三维结构重建等应用于大肠癌的研究作一综述。

　　近年来大肠癌在我国的发病率有逐年上升的趋势，95年Wingo等报道的美国肿瘤流行病学监测结果中：大肠癌的发病率和死亡率在所有肿瘤分别占11%、10%[2]。掌握大肠癌的发生发展规律及诊断和预后的方法有重要意义。传统的定性诊断由于缺乏客观指标和受主观因素的影响，使诊断的客观性和准确性在一定程度上受到限制。随着显微测量技术的发展和计算机的广泛应用，大肠癌病理研究从定性描述走向了定量分析，为探讨大肠肿瘤发生发展规律及提高诊断水平开辟了一条新途径。国外定量病理研究开展较早，有的已将定量病理测试和分析作为常规内容，国内起步较晚但发展较快[1]。目前大肠癌定量病理学应用研究的主要内容有：形态结构定量、DNA定量、核仁组成区相关嗜银蛋白（AgNORs）定量、分子病理学定量、免疫组化定量及三维重建等，以前三者研究较多。本文将分别综述这几方面的研究状况。

　　1 大肠癌的形态定量

　　1.1 形态定量含义及参数指标

　　形态定量是对组织的形态结构进行定量分析，它通过有关的量化指标反映组织的结构特点。国内外目前对大肠癌形态定量研究主要测试了以下形态结构参数：细胞核面积、周长、长轴、短轴、形状因子、核浆比、核的体积密度、表面积密度、平均直径、数密度、腺体的体密度、平均曲率、平均曲率的均值、体积及重平均体积、表面积与体积比等[3，4，5，6]。

　　1.2形态定量的测试方法

　　有网格测试和仪器测试两类方法。仪器测试包括基于计算机分析的数字化仪和图像分析仪，目前人们把图像分析技术用于形态定量，即通过数字化仪或/和摄像系统将宏观或显微图像输入计算机处理和分析，具有测量快、准确性高及客观性强等优点。

　　1.3形态定量在大肠癌发生发展和诊断中的应用

　　肿瘤组织结构的异型性和瘤细胞的形态变化的是常规病理诊断的重要依据，光镜观察对细胞核形态只能作大致的描述，易带主观性。形态定量分析能量化反映组织和细胞的形态结构，可排除主观因素的影响。国内外学者通过对大肠癌形态定量研究，发现人大肠癌直接由粘膜发生的只是少数，多数是在腺瘤基础上发生癌变，提出了大癌的发生发展模式：腺瘤→癌模式。定量形态学参数可作为表达大肠癌及癌前病变的客观指标，大肠肿瘤是重要的癌前病变，形态学上对其非典型增生程度分级的不一致性有时可达34%-41%[7]。形态定量分析可弥补这一不足。核形态定量分析可为非典型增生程度的分组提供定量的客观依据。根据形态定量参数的大小， Meijer在研究肿瘤不典型增生时，发现各参数值向两端集中，即向轻度不典型增生和重度不典型增生值集中，提出肿瘤不典型增生似乎分为二个等级比三个级别更合适，即轻度不典型增生和重度不典型增生[8]。Sato对一组大肠病变细胞超微结构的定量形态学研究显示，随着细胞逐渐取得恶性特征，细胞核逐渐变圆，癌细胞的核最圆，形态因子（PE）最大。Hajima[9]的研究显示：形态定量中核浆比按大肠正常粘膜和轻、中、重度不典型增生、癌的顺序而增大，除中、重度不典型增生外，各病变均有显著差异，认为它是一项有价值的诊断指标。易平勇等人通过形态定量参数分析发现：绒毛状腺瘤比管状腺瘤更易癌变。Riddell等人分析核短轴、核浆比、核形状因子的变化特点，发现轻、中度不典型增生均与癌有显著性差异，而重度不典型增生与癌的差异性不显著，认为二者间只有量的差异而无质的区别，甚至把重度不典型增生称为浸润前癌，并认为重度不典型增生将不可避免发生癌变，周水云等在研究大肠肿瘤分级诊断时提出了细胞核形态定量参数分析联合DNA指数（倍体）分析能对大肠腺上皮各级异形增生及肿瘤癌变作出较正确的分级诊断和鉴别诊断[10]。此外我们用计算机图像分析技术对大肠癌、腺癌上皮细胞进行色度学定量分析，提出了大肠肿瘤和腺癌亚型的细胞来源分类法[11]。

　　1.4 大肠癌的形态定量与预后

　　定量病理学形态定量研究中可根据癌细胞的各种各参数大小对预后进行判断。有文献报道大肠癌细胞的形态因子PE越大，其预后愈差[12]。Mitmaker等人的研究认为形状因子PE指数大于0.84是预后不良的标志[13]。易平勇等人对大肠癌核的形态定量研究时注意到：核面积、核周长、核等周直径、核体积、核面积标准差的大小变化可反映五年存活率的高低，癌细胞形态表达为大核者，其预后差。核浆比率可作为结直肠癌的重要预后参数指标[14]，Garson[15]等人的研究认为大肠癌病人癌细胞核的体密度较大者，其生存期长，预后较好，表明癌细胞核的定量与预后关系密切。

　　2 大肠癌的DNA定量与倍体分析

　　2.1 DNA定量理论的含义及定量指标

　　DNA含量是指细胞内含有DNA的相对量，它能反映细胞核酸代谢情况。人的正常细胞染色体的数目和形状是相对稳定的。每一体细胞具有46条染色体，可配成23对，称二倍体；当染色体的数目整组增加，超过三倍体者称为多倍体。应用细胞分析仪进行DNA测量，可反映细胞染色体的畸变。一些研究认为，肿瘤细胞DNA呈非整倍体意味着该肿瘤为恶性[16]。细胞核DNA定量指标较常用的有：⑴DNA指数（DI）：反映肿瘤细胞DNA相对含量的平均水平；⑵二倍体偏离指数（2CDI）：显示肿瘤细胞DNA含量偏离二倍体的程度，文献认为该参数在表达DNA含量异常的程度较DNA指数好[17]；⑶积分光密度（IOD）：间接反映细胞核DNA相对含量；⑷主峰倍体值（SP）：如果主峰倍体值小于1.9C或大于2.1C则可认为该样本为非整倍体，如果参照细胞的变异系数值小于3%则主峰值只要在1.94C或大于2.04C即可定为非整倍体[18]。

　　2.2 DNA定量分析的方法

　　目前DNA定量分析的方法主要有二种，一种是流式细胞术：这是一项用流式细胞仪对悬液中流动的荧光标记的大量单细胞进行快速精确的定量分析技术；另一种是胸态图像分析术，如图像分析仪、显微荧光光度计、显微分光光度计等，它是对显微镜下的静态细胞图像进行定量分析。夏潮涌报道目前主要采用流式细胞术（FCM）和细胞图像光度术（ICM）测量和分析细胞学样品单个完整肿瘤细胞的DNA含量的倍体，国际分析细胞学会和国际细胞学会分别为FCM和ICM作细胞核DNA含量与倍体分析推荐了统一标准[19]。Diest在评价ICM的应用时提出：虽然ICM测量速度不如FCM快，但它可以直观地检测细胞，随时测量其结构特征，在发现少有的核变化上优于FCM[20]。97年国际定量病理会议讨论了FCM在人体实性肿瘤的诊断和预后价值，并指出FCM在肿瘤发生前能提供客观诊断资料；在早期癌检测中能提高诊断效果；在确定大多数肿瘤的预后、复发、死亡等方面有显著的临床价值[21]。在DNA定量分析方法的标本应用方面除了切片外也可作涂片、印片等可作参考。

　　2.3 DNA定量分析在大肠癌发生发展及诊断中的应用

　　大肠肿瘤并非由正常细胞一跃而成为癌细胞，通常需有量变到质变的发展过程。大肠腺瘤被认为是大肠癌的主要来源，分析癌前细胞DNA的含量变化有助于探讨癌变的发生发展规律。国内外大量病理和临床研究资料表明：肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤的重要标志之一，DNA异倍体出现是肿瘤生物学行为恶性、预后不良的重要特征，测试胞核DNA含量并进行倍体分析对恶性肿瘤的病理诊断、分类分级、预后判断有重要价值[22，23]。研究发现[24]：大肠腺瘤样息肉病例肿瘤细胞DNA含量均在正常范围内，但当腺瘤样息肉伴有不典型增生和癌变时，细胞核平均DNA含量呈递增趋势，但是正常粘膜、腺瘤、腺癌各组间有较大的重叠。Seiynu等[25]人用流式细胞仪分析大肠癌细胞时发现：DNA非整倍体在腺瘤阶段已发生，这一结果不但支持了腺瘤→癌模式的理论，而且表明DNA非整倍体可能是结肠息肉恶变诊断的早期指标之一。DNA非整倍体在恶性病变前二年即可检测到[26]。有报道某些溃疡性结肠炎可以不经过异型增生阶段直接发生癌变，此时DNA倍体分析显得更有意义[27]。Hammarberg报告[28]活检系轻度不典型增生、DNA含量明显增高且DNA直方图呈二个异倍体细胞群的慢性溃疡性结肠炎，一年后复查发现相应部位发生肿瘤，为中分化腺癌；此外慢性溃疡性结肠炎异倍体随病程延长而增加，异倍体发生率与癌变率平行。郑香玲等研究认为：恶性肿瘤的分化程度与DNA含量和倍体类型有关，分化程度越差其DNA的含量越高，高、中、低分化腺癌细胞核DNA的非整倍体不断增多，DNA含量直方图峰值向右偏离，而良性肿瘤细胞DNA含量高于正常细胞，4倍体增多[29]。

　　2.4 DNA定量分析与预后

　　肿瘤细胞核DNA含量与临床预后有明显关系，一般认为DNA倍体量的变化与临床预后的时间长短成反比。Roguum检测了100例大肠癌术后患者，发现二倍体细胞患者五年生存率明显高于非整倍体细胞患者，他认为非整倍体细胞是影响预后的一个独立因素，他还证实Dude'sD或C期患者非整倍体更常见，预后差[30]。而Thomas等人则认为：肿瘤细胞DNA含量依然是一个有争议的预后指标，DNA含量没有单独提供额外的预后信息，大肠癌预后由临床和组织病理学指标所决定，即取决于肿瘤的部位、肿瘤浸润深度、淋巴结的转移以及病理分级[31]。Reiping等人在研究大肠癌DNA倍体和流式细胞计数与组织病理学参数及预后的估价时批出：DNA倍体的类型同一些组织病理学指标改变相关，即与肿瘤的部位、恶性度的病理分级、血管淋巴管的浸润及淋巴结的转移等有关。如：远端结肠癌的非整倍体较近端的非整倍体为多，病理分组中恶性度高的多为非整倍体，二倍体肿瘤多局限于粘膜下层且很少与淋巴结转移有关，有血管淋巴管浸润的结直肠癌非整倍体更高，但流式细胞计数同病理分级的各级大肠癌病人的生存期无关[32]。还有研究表明：DNA非整倍体与大肠癌的生物学行为相关，为不良预后的一个可靠参数[33]。总体来看，大肠癌细胞核DNA含量的升高，非整倍体出现与预后的关系不可忽视。

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