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balicha

[交流] 【转帖】农业试验测定方法大全

淀粉酶的定测

称取鲜样0.2克，加1%NaCl8毫升研磨（低温），放置15分钟，不时摇动。3000rpm离心10分钟。
（1）        取1ml酶液，加1％淀粉1ml
（2）        空白：取1ml酶液，100度水浴10min，加1％淀粉1ml，混匀，40度水浴5min（准确）,取出，将各试管各加入DNS　2ml，煮沸5min，冷却，定容至25ml，然后在520nm下比色。
注：淀粉临时配制。1％淀粉：1g溶于100ml水中。
DNS试剂：精确称取3、5－二硝基水杨酸1g溶于20ml1mol/lNaOH中，加50ml蒸馏水中，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后盖紧瓶塞，勿使CO2进入。
麦芽糖标液  称取麦芽糖0.1000g溶于少量蒸馏水中，定容至ml即为1mg/ml的麦芽糖标液。
标准曲线的制作：取25ml具塞刻度试管7支，按下表加入各种试剂混匀，在沸水浴中加热5分钟，取出，冷却后加蒸馏水至25ml刻度，摇匀，在520nm下比色，绘出标准曲线。
管号        麦芽糖含量（ml）        麦芽糖标液（ml）        蒸馏水（ml）        DNS试剂（ml）
0
1
2                 
3
4
5
6                     0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0        0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0        2.5
2.3
1.9
1.5
1.1
0.7
0.5        2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0

硝酸还原酶的测定
试剂：1、亚硝酸钠标准液：称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100毫升，吸取5毫升用水稀释定容至1000毫升。
2、0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液 K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000毫升。
3、1% 对氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25毫升浓盐酸中，用蒸馏水定容至100毫升。
4、0.2% α—萘胺溶液：称取0.2g α—萘胺溶于25毫升冰醋酸中，用蒸馏水定容至100毫升。
5、30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸，水溶后定容至250毫升。
6、KNO3•异丙醇•磷酸缓冲液混合液：称3.03g KNO3溶于300毫升0.1mol/l的磷酸缓冲液中，再加3毫升异丙醇混匀。
方法
1、标准曲线的制作：取7支干洁的15毫升刻度试管按下表顺序加试剂，摇匀后在30度保温箱或恒温水浴中保温30分钟，然后在540nm波长下比色。

1        2        3        4        5        6        7        备注
亚硝酸钠标准液        0        0.2        0.4        0.8        1.2        1.6        2.0       
蒸馏水        2.0        1.8        1.6        1.2        0.8        0.4        0.0        摇匀
1% 对氨基苯磺酸        4        4        4        4        4        4        4        摇匀
0.2% α—萘胺溶液        4        4        4        4        4        4        4        摇匀
每管含亚硝酸态氮（μg）        0        0.2        0.1        0.8        1.2        1.3        2.0       

2、酶反应和酶活性测定：
①取样：将材料洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干，剪成0.5-1.0平方厘米的小块，混匀后每个样品称0.5-1.0克3份，放入试管并编号。
②反应：向各试管中加入KNO3•异丙醇•磷酸缓冲液混合液9毫升，其中一管立即加1毫升30%三氯乙酸溶液，混匀（作对照）。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30度下于黑暗中保温30分钟，分别向处理管加1毫升30%三氯乙酸溶液，摇匀终止酶活性。
③：比色：将各试管静止2分钟吸取上清液2毫升加入另一组试管，分别加入1% 对氨基苯磺酸溶液4毫升和0.2% α—萘胺溶液4毫升，摇匀显色30分钟，以对照为空白，在540nm波长比色，并计算酶活性。
酶活性（Nμg•g-1FW•h-1）=标准曲线查得值（μg）*分取倍数/ 样重（g）/时间（h）





硝酸还原酶活力的测定(活体法)
[试剂]
亚硝酸钠标准液   称取分析纯NaNO20.1000g水容后定容至100ml,吸取5ml用水稀释至1000ml,即为每ml含NaNO25µg(亚硝态氮近似1µg/ml)的标准液.
0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：   K2HPO419.24g, KH2PO4 2.2g,加水溶解定容至1000ml..
1%(w/v)对-氨基苯磺酸溶液：    称取1.01g加入25ml浓HCL中,用蒸馏水定容至100ml.
0.2%(w/v)a-萘胺溶液：        称取0.2g  a-萘胺溶于25ml冰醋酸中,用蒸馏水定容至100ml.
30%三氯乙酸溶液：         30.0g三氯乙酸,水溶后定容至100ml.
KNO3(0.1mol/L)、（1%v/v）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液；  称取3.03gKNO3溶于300ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。
[方法]
1．        标准曲线制作  取7支洁净烘干的试管按下表顺序加试剂，即配成0-2.0ug的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30保温箱或恒温水浴中保温30min，然后，在540nm波长下比色。以亚硝态氮（µg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。
试剂（ml）        1        2        3        4        5        6        7
亚硝酸钠标液
蒸馏水
1%对-氨基苯磺酸
0.2% a-萘胺
每管含亚硝态氮（µg）        0
2.0
4
4
0        0.2
1.8
4
4
0.2        0.4
1.6
4
4
0.4        0.8
1.2
4
4
0.8        1.2
0.8
4
4
1.2        1.6
0.4
4
4
1.6        2.0
0.0
4
4
2.0

2．        酶反应和酶活性测定
（1）        取样 称取0.5000g烟叶（剪成0.5-1.0cm的小块），混匀后放入试管，重复2次。
（2）        反应 向各试管加入KNO3-异丙醇-磷酸缓冲液混合液9ml,其中一管立即加入1.0ml三氯乙酸,混匀(做对照).然后将所有的试管置于30°C下于黑暗处保温30min,分别向各处理管中加1.0ml三氯乙酸,摇匀终止酶活性.
（3）        比色 将各试管静止2min,吸取上清液2ml加入另一组试管,以对照管做参比,按标准曲线做法进行显色测定,并计算酶活性.






转化酶的测定
转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。
试剂：1、10%蔗糖溶液
2、葡萄糖标准液（500μg/ml）
3、0.05mol/l的磷酸缓冲液
4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。
方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。
2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。
3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定
①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：
管号        1        2        3        4        5        6
葡萄糖原液量（ml）        0        0.4        0.8        1.2        1.6        2.0
加蒸馏水量（ml）        2.0        1.6        1.2        0.8        0.4        0
葡萄糖浓度（μg/ml）        0        100        200        300        400        500
在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。
4、结果计算：
A=(N-N’)*V/(T*W*1000)
A：转化酶的活性(mg/gfw/h)                N：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)
N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)   V：酶反应液的总体积
T：反应时间                             W：材料鲜重


多酚氧化酶的测定
试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。
2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。
3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。
4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。
贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4•H2O用蒸馏水配成1000ml）。
贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4•7H2O或71.7g Na2HPO4•12H2O用蒸馏水配成1000毫升）
5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）
方法：
1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。
2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。
3、结果计算：A多酚=0.44{[⑥-(④+⑤)/2]-[③-(①+②)/2]}*V1/V2/W/t
V1：提取时酶液总量（毫升）  V2：测定时酶液用量（毫升）
①、②、③、④、⑤、⑥：测定时消耗碘液量（毫升）  t：酶反应时间（分）



磷酸缓冲液        抗坏血酸        焦儿茶酚        酶 液        偏磷酸        备    注
1        4        2                2                测坏血酸氧化酶
2        4        2                2                同上
3        4        2                2        1        空白测定
4        4        2        1        2                测多酚氧化酶
5        4        2        1        2                同上
6        4        2        1        2        1        空白测定




淀粉的测定方法-----------蒽酮法
一．        原理
用乙醇将烟叶中可溶性糖浸出并分离出去，而后烟叶中淀粉用适量Hcl，因淀粉在稀酸作用下被水解成葡萄糖，再按葡萄糖测定进行。根据葡萄糖的含量从而算出淀粉含量。
二．        仪器设备
三角瓶-50ml   容量瓶-100ml   移液管10ml、1ml   漏斗  圆底烧瓶1000ml  离心管和离心机  水浴锅   温度计  烘箱  滤纸   天平  分光光度计
三．        试剂
盐酸  乙醇 氢氧化钠  蒽酮
四   试剂的配制和标准曲线的绘制
1. 葡萄糖标准液的配制  称取无水葡萄糖（AR级）0.1g溶于蒸馏水中，定容至100毫升，用前取此液10毫升，再用水稀释至100毫升。
2.. 标准曲线的绘制    取6支干洁刻度试管，依次移入葡萄糖标准液（100μg/ml）0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml后，再从1至4试管依次补加1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0ml蒸馏水后，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，以吸光值为纵坐标，糖含量为横坐标，绘出标准曲线
3. 80%乙醇的配制    取400毫升乙醇加水定容至500ml
4. 1当量的盐酸配制  43毫升浓盐酸加水定容至500ml
5. 10%氢氧化钠配制  10g氢氧化钠溶于100ml水中
6. 蒽酮试剂：1克蒽酮溶于72%的H2SO41000ml(98%的H2SO4+240的蒸馏水)，棕色瓶冰箱保存2~3周。
五   实验步骤
1. 分离出水溶性糖
0.1g样      置于离心管中     加入8毫升80%乙醇     80℃水浴浸提30分钟冷却后离心5分钟     残渣再加入8ml80%乙醇。重复三次

2. 水解
残渣用1当量的盐酸15ml洗入50ml三角瓶，摇匀后烘箱105度加热3.5小时，冷却后加10%氢氧化钠6ml中和，蒸馏水定容100ml，过滤
3. 测定
取滤液1ml（空白用1ml蒸馏水代替），加入蒽酮试剂5ml，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色
六  结果的计算与表述
C=AN*0.9/W
C—样品淀粉含量（μg/g）         
W—样品重量（g）
A—标准曲线查得的糖量（μg）      
N—样品提取液占样品反应液的倍数
酸解法测定淀粉
方法1 1.将除去可溶性糖的残渣用80%乙醇洗入50ml三角瓶（3次重复），水浴或100~105度烘箱加热2~3小时，10%NaOH中和至微碱性（1滴甲基红指示剂，变黄），转入100ml容量瓶，慢慢加入5%ZnSO4和0.15mol*l-1Ba(OH)25ml至产生白色沉淀，加水到刻度，混匀过滤，滤液备用。
2.测定：吸取滤液6ml，加斐林试剂4ml混匀加塞，于沸水浴中加热15分钟，取出后流水冷却，再经1500转离心5分钟，收集上清液，在590nm波长处比色 。
3. 标准曲线的绘制：取干洁试管7支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、1、2、3、4、5、6ml和蒸馏水6、5、4、3、2、1、0ml，加斐林试剂4ml混匀加塞，于沸水浴中加热15分钟，取出后流水冷却，再经1500转离心5分钟，收集上清液，在590nm波长处比色 。
斐林试剂:A液—（CuSO4*5H2O）40克后蒸馏水定容1000ml,B液—酒石酸钾钠（KNaC4O6*4H2O）200克与NaOH150克后蒸馏水定容1000ml；最后将A液B液等体积混匀。
葡萄糖标准液：80度烘干葡萄糖0.1000克蒸馏水定容100ml，浓度为1mg*ml-1。
滴甲基红指示剂：0.2克溶于少量酒精后蒸馏水定容100ml
方法2.  1. 1.将除去可溶性糖的残渣用1当量HCl15ml洗入150ml三角瓶（3次重复），摇匀后100~105度烘箱加热2~3小时，冷却蒸馏水定容100ml 过滤加  10%NaOH6 ml中和
2. 测定：取滤液1ml（空白中用1毫升蒸馏水代替）加入蒽酮试剂5毫升，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色 。
1当量HCl：43 mlHCl蒸馏水定容500ml
3、标准曲线的绘制：取干洁试管6支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，绘出标准曲线。
4、计算：C=AN*0.9/W
C—样品总糖含量（μg/g）   W—样品重量（g）
A—标准曲线查得的糖量（μg）  N—样品提取液占样品反应液的倍数
推荐干重0.5~1克鲜重1~2克或参考参考书

[ Last edited by laizuliang on 2007-12-25 at 13:06 ]
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1楼 2006-04-18 19:24:45
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balicha

氯化三苯基四氮唑（TTC，桶栽）根系活力
试剂：
1、乙酸乙酯
2、低亚硫酸钠（Na2S2O4        ，俗称保险粉）
3、1%TTC溶液：准确称取TTC 1.0克，溶于少量蒸馏水中，定容至100毫升
4、0.4% TTC溶液：准确称取TTC 0.4克，溶于少量蒸馏水中，定容至100毫升
5、1/15mol/l pH7.0磷酸缓冲液
6、1mol/l硫酸：用量筒量取比重1.84的浓硫酸55毫升，边搅拌边加入盛有500毫升的蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000毫升
7、0.4mol/l琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6个结晶水）10.81克，溶于蒸馏水中，定容至100毫升
方法：1、TTC标准曲线的制作：吸取0.25ml0.4% TTC溶液放入10毫升刻度试管中，加少许低亚硫酸钠粉末，摇匀后立即产生红色的TTF，再用乙酸乙酯定容至10毫升，摇匀，然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.5ml、2.0ml置于10毫升刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF 25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比在485nm波长处测定光密度，绘制标准曲线。
2、称取根样品0.5克，放入试管中，（空白先加1mol/l硫酸2毫升再加入根样品），加入0.4% TTC溶液和1/15mol/l pH7.0磷酸缓冲液各5毫升，把根充分浸没在溶液中，在37度下暗处保温1个小时，此后加入1mol/l硫酸2毫升，以终止反应。
3、把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4毫升和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10毫升，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量。
4、计算：四氮唑还原强度=四氮唑还原量（μg）/根重（g）/时间（h）







丙二醛的测定(MDA)
试剂：0.5%硫代巴比妥酸：称取硫代巴比妥酸0.5g溶于5%三氯乙酸溶液，并用其定容至100毫升。
方法：1、样品制备：称叶片0.3g于研钵中，加入少量石英砂和蒸馏水2毫升，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用蒸馏水3毫升分两次冲洗研钵，合并提取液。
2、显色反应：在提取液中加入0.5%硫代巴比妥酸5毫升，摇匀，将试管放入沸水浴中煮沸10分钟，（自试管内溶液中出现小气泡时开始计时），到时间立即取出试管并冷却。
3、比色测定：待试管内溶液冷却后，在3000转离心15分钟，取上清液并量其体积。以0.5%硫代巴比妥酸为空白测定534nm和600nm处的吸光值。
4、结果计算：C=（OD534-OD600）*V/0.155d/W
C：丙二醛含量（μmol/g）       d：比色杯光径
W：样品重量                   V：上清液总体积
0.155：丙二醛的μmol吸光系数
丙二醛的测定方法
1．        取叶0.5000g加少量（2mg）10%的TCA研磨匀浆，转入离心管，并用TCA 6mg清洗研钵（TCA共用8mg），然后摇匀，离心10min（3000rpm）,取上清液待测.
2．        显色反应:取上清液3ml+TBA 3ml(对照管TCA 3ml+TBA 3ml),分别置于试管中，用塑料膜封口,沸水浴20min显色,冷却.
3．        比色:分别在A532和A600处比色.
4．        计算:
MDA(nmd•g-1•FW)=[(A532-A600)*L*V/v]/1.55*10-1*W
               =(A532-A600)/W*103.226

式中:L为反应液总量(ml)
    V为提取液总量(ml)
    v为测定时提取液用量(ml)
TCA(三氯乙酸):称25.000g三氯乙酸溶解,定容至250ml.
TBA:称0.6000g硫代巴比妥酸,用10%的TCA定容至100ml.







        游离脯氨酸的测定
1．        称取0.5000g剪碎烟叶加入试管，加5ml3%磺基水杨酸，封口，沸水浴10min；过滤后备用。
2．        吸取2ml提取液加入试管（对照管用2ml水代替），各加入2ml冰醋酸，4ml茚三酮，摇匀，煮沸30min，冷却比色（OD520）
试剂配制：
1．        3%磺基水杨酸：称3.000g磺基水杨酸溶解，定容至100ml。
2．        茚三酮：称2.50g茚三酮，加60ml冰醋酸和40ml 6M磷酸，在热水（70°C）溶解，一般现用现配（24小时）
6M磷酸：吸取86ml磷酸，定容至250ml.
计算：脯氨酸（µg•g-1•FW）=(C*V/a)/W*100
=C*250/W
C:浓度  a:2ml
V：5ml  W：0.5000g
标准曲线：
称取10mg脯氨酸容于少量乙醇中，用蒸馏水定容至100ml，成10µg•ml-1的母液.
取母液0.0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0ml分别放入7个25ml容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容，配制成0、2.0、5.0、10、20、30、40µg•ml-1的系列溶液。
分别取上述各溶液2ml，加入已编号7个试管中，再分别加入2ml冰醋酸，4ml酸性茚三酮试剂，摇匀后，在沸水浴中加热显色60min，冷却后于520nm处比色.

总酚类和类黄铜含量的测定
取0.5000g新鲜烟叶剪成1-2mm小块后,加5ml含1%HCL的甲醇溶液,提取24小时(4°C),取0.5ml提取液，用蒸馏水稀释至25ml.在280nm、325nm处比色。类黄铜含量以OD325/g鲜重表示，总酚含量以没食子酸标准曲线加以计算，即：
     
总酚含量（mg/g）=C*5*50/鲜重（g）
类黄铜含量（OD325/g鲜重）=OD325/鲜重（g）
试剂配制：
1．        没食子酸标准曲线
原液（0.05mg/ml）：称取0.00250g没食子酸，定容至500ml。
分取0.5、10、15、20、25ml原液定容至25ml作标准曲线。
2．1%HCL甲醇：取13.5ml浓HCL+482.5ml甲醇配制成500ml）。


        丙酮提取分光光度法测定色素
仪器：分光光度计、50ml容量瓶、漏斗、滤纸、分析天平、移液管、乳钵
试剂： 80%丙酮（水20+丙酮（GR）80，v/v）
试验步骤：
待测液制备：样品0.5—2g放入乳钵，加入适量80%丙酮，研磨至残渣变白，静置片刻，过滤于50ml容量瓶中，将残渣与滤纸反复冲洗（至滤纸变白），洗液过滤，定容至刻度
吸光度测定：色素提取液倒入比色杯，分别于662、644、和440nm下比色，记录OD值
叶绿素a：Ca(mg/l)=9.784OD662-0.990OD644
叶绿素b：Cb(mg/l)=21.426OD644-4.650OD663
叶绿素： Ct(mg/l)=Ca+Cb=5.134OD662+20.436OD644
类胡罗卜素Cc(mg/l)=4.695OD440-0.268（Ca+Cb）
色素含量（mg/l）=浓度（mg/l）*提取液总量（l）/样重（g）

叶绿素的测定方法
[方法]
称取0.1000g剪碎的新鲜的烟叶放入10ml的容量瓶中,用80%的丙酮定容至10ml.放在黑暗处浸提24小时.然后在663nm、646nm处比色。
[计算]



Ca=12.21*D663-2.81*D646
Cb=20.13*D646-5.03*D663







蒽酮比色法测总糖：
实验步骤：
1、可溶性糖的提取：准确称取烟叶样品0.100克，置于离心管中，加入8毫升80%乙醇，于80℃水浴浸提30分钟，冷却后于4000转离心5分钟，收集上清液，残渣再加入8毫升80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100毫升容量瓶中并定容至100毫升。
2、总糖的测定：取提取液1毫升于试管中（空白中用1毫升蒸馏水代替），加入蒽酮试剂5毫升，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色 。
蒽酮试剂：1克蒽酮溶于72%的H2SO41000ml(98%的H2SO4+240的蒸馏水)，棕色瓶冰箱保存2~3周。
3、标准曲线的绘制：取干洁试管6支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，绘出标准曲线。
4、计算：C=AN/W
C—样品总糖含量（μg/g）         
W—样品重量（g）
A—标准曲线查得的糖量（μg）      
N—样品提取液占样品反应液的倍数
3，5—二硝基水杨酸（DNS）比色法测还原糖
实验步骤：
1、可溶性糖的提取：准确称取烟叶样品0.100克，置于离心管中，加入8毫升80%乙醇，于80℃水浴浸提30分钟，冷却后于4000转离心5分钟，收集上清液，残渣再加入8毫升80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100毫升容量瓶中并定容至100毫升。
2. 还原糖的测定：取提取液1毫升于试管中（空白中用1毫升蒸馏水代替），加入DNS试剂1.5毫升，摇匀，于沸水浴中加热5分钟，取出后立即浸入冷水冷却至室温后在520nm波长处比色 。
DNS试剂：A液—结晶酚6.9克溶于15.2ml10%NaOH,在稀释到69ml后加6.9克Na2SO3;
B液—酒石酸钾钠225克溶于300ml10%NaOH后加1%DNS880ml;最后将A液B液混匀（黄色）棕色瓶室温下7~10天后即可用。
3、标准曲线的绘制：取干洁试管6支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入DNS试剂1.5毫升，于沸水浴中加热5分钟，取出后立即浸入冷水冷却至室温后在520nm波长处比色 。
4、计算：C=AN/W
C—样品还原糖含量（μg/g）         
W—样品重量（g）
A—标准曲线查得的还原糖量（μg）      
N—样品提取液占样品反应液的倍数
           

总氮的测定
过氧化氢—硫酸消化法：
实验步骤：
1、消化：准确称取磨细混匀的烟叶干样0.2000克，装入100毫升凯氏瓶的底部，加入浓硫酸8毫升，混匀浸润后，放置过夜。在红外线消化炉中慢慢地加热至开始冒出大量白烟，微沸约5分钟。取下稍放冷（约两分钟），逐滴加入30%H2O2约0.5毫升。继续加热微沸2~5分钟。取下稍放冷，添加几滴H2O2。再加热消煮，如此直至消煮液完全清亮为止，然后再微沸5分钟，以除尽剩余的H2O2。冷却后加入10毫升水，无损地转入100毫升容量瓶中，用水多次洗涤，冷却后定容。
2、蒸馏：用移液管吸取以上所制备的消化液5~10，放入半微量凯氏氮素蒸馏器的内室，加入约5毫升40%氢氧化钠，使全部溶液呈碱性，立即夹紧入口处，进行蒸汽蒸馏，蒸馏液有3~5毫升（其中加有溴甲酚绿—甲基红指示剂二滴）的2%硼酸吸收，馏出液约达50毫升时，用0.02N标准酸滴定氨，滴至刚显红色为止。记下滴定用去标准酸的体积，同时作空白试验。
3、计算： 烟叶的全氮%=NV×0.014×取用倍数×100/W/（1-含水率

                      烟碱的测定
盐酸萃取法：
   实验原理：
            烟叶中的烟碱在强酸条件下，可丛烟叶中脱离出来，同时色素进入提取液，利用活性炭的吸附作用脱色、烟碱对特定波长的光有吸收能力，测定烟碱的含量。
   测定步骤：
          1．待测液的制备 称取0.030g样品放入100ml的三角瓶，加1/3角匙的活性炭和25ml0.5N的盐酸。振荡5分钟，过滤到100ml的容量瓶中，洗三角瓶、合并滤液并定容摇匀待测。
              2.空白 取0.5N25ml盐酸加入容量瓶中，定容摇匀。
         3.测定 以空白参比在分光光度计仪器上调读数为零，在3个波长处（236nm.259nm.282nm）分别测定A。
         4.数据计算：
烟碱%=1.059×｛A259－0.5（A236+A282）｝×100×100/W(1－水%)×343×1000


       

游离氨基酸的测定—茚三酮比色法
实验原理： 游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化合物二酮茚－二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉.
仪器与用具：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶 研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×1;沸水浴；具塞刻度试管20ml×10;分光光度计.
试剂：10%乙醇；
水合茚三酮  称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml正丙醇、30ml正丁醇、60ml亿二醇及9mlPH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。
4mol/LPH4.54的HAc-NaAc缓冲液：
称取54.4 醋酸钠，加入100ml蒸馏水，加热至沸，蒸发至原体积的一半，冷却，转入100ml容量瓶，加入30ml冰醋酸，定容。
氨基酸标准液：
称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg,以10%的异丙醇溶解定溶至50ml(含氮为50ug/ml),取此液5ml,用水定溶至50ml,此为含氮5ug/ml工作液。
0.1%抗坏血酸：称0.1g抗坏血酸定容100ml,随用随配。
  测定步骤：
  标准曲线：
取6支20ml试管，按下表加剂：
        1        2        3        4        5        6
50ug/ml
亮氨酸        0        0.2        0.4        0.6        0.8        1.0
无氨蒸馏水        2.0        1.8        1.6        1.4        1.2        1.0
水合茚三酮        3.0        3.0        3.0        3.0        3.0        3.0
抗坏血酸        0.1        0.1        0.1        0.1        0.1        0.1
氨基氮量ug/管        0        1.0        2.0        3.0        4.0        5.0
混匀，封口，沸水浴加热15分钟，冷水中摇动冷却，至红色褪色，溶液呈蓝紫色，用60%乙醇定溶至20ml，摇匀，于570nm测定吸光度。以吸光度为纵坐标，氨基氮ug数为横坐标，绘标准曲线
待测样测定：
取20ml试管，取A液1ml，加蒸馏水1 ml，水合茚三酮3 ml，坏血酸0.1 ml，混匀，封口。沸水浴加热15分钟，冷水中摇动冷却，至红色褪色，溶液呈蓝紫色，用60%乙醇定溶至20ml，摇匀，于570nm测定吸光度。
计算：求三重复的平均值，由标准曲线得知各样的氨基酸ug数，代入公式计算。
  氨基酸含量（mg/g干样）=｛氨基酸ug数×（提取液总体积/测  
定体积）｝/（样品g数×1000）
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2楼2006-04-18 19:26:10
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balicha

单位叶面积重（分部位作试验后剩余叶片）：
每片叶打孔一片，共计六十片，105度刹青10分钟，75度烘至恒重，称量
        土壤
1土壤容重，土壤毛管持水量和最大吸湿水量（土壤实际含水量的测定方法也同于此，只是取的是实测土样）
a.最大吸湿水的测定：在分析天平上称出干燥而洁净的铝盒重量〔W〕，然后放入约5克风干土，盖上盒盖，准确称重(W 1)，再将盖打开放入烘箱中，控制在105℃范围；连续烘干6—8小时，取出铝盒迅速放入干燥器中，冷却至室温(约半小时)，然后取出立即称重（W2）。再放入烘箱中，烘干3—5小时，在干燥器内冷却，再称重，检验是否恒重。实际上只要两次称重不超过3毫克即可进行计算。
土壤最大吸湿水％＝100×（W1-W2）/（W2-W）
式中 W为铝盒重量〔g〕
W1为铝盒+风干土重〔g〕
W2为铝盒+烘干土重〔g〕
b土壤毛管持水量的测定：用环刀按土壤剖面层次取原状土，然后将有孔并附滤纸的环刀盖盖好，放入盛有薄层水的磁盘中，保持水深2—3毫米。此时水分受毛管力的作用，沿毛管孔隙上升，浸泡约4—12小时(砂土4小时；粘土8—12小时)，取出环刀，用滤纸擦干环刀外部，放在已知重量的表玻璃上称重，然后再将环刀放回原处吸水至泡和 （砂土2小时；粘土4小时）。如此操作直到恒重为止。将土放入烘箱中，控制在105℃范围烘干，测定含水量，计算毛管持水量。
土壤毛管持水量%=100×（湿土重-烘干土重）/烘干土重
c.土壤容重的测定——环刀法

1）挖土壤剖面，分层削出横平而：在野外选好剖面点，挖好剖面后，用削面刀修乎，分层确定测土壤容重的层次部位，在取土部位修一横向平面，为环刀取土作好准备工作。
2)环刀取土方法：将环刀托套在已知重量环刀无刃口的一端，环刀内壁微涂凡士林。环刀刃口朝下，用力均衡地下压环刀托把，将环刀垂直压入土层平面以下。如土层紧实较硬时，可用木锤轻轻敲打环刀托把，待整个环刀全部压入土中，且土面即将触及环刀托的顶部(可由环刀托盖上的小孔探视)时停止下压。用铁铲把环刀周围土壤挖出，切断环刀下方，并使其下方留有一些多余的十壤。慢慢取出环刀，使它翻转过来，刃口朝上，用削土刀迅速削去附近在环刀壁上的土壤，然后在刃口一端从边缘比中心部位逐渐削平土壤，使之与刃口完全齐平。盖上环刀顶盖，再次翻转环刀，使盖好顶盖的刃口一端朝下，取下环刀托，同样削平无刃口一端的土面，并盖好底盖，注意削平土面时，要细心，否则容易成块脱落，以至因土面不平土样作废。环刀取土后要擦净环刀外粘附的土壤。测湿土重，准确到0．1克，并记录其重量
3) 测.土壤含水量：在环刀采样处另取土样，测定.土壤含水量或直接用环刀内土样测含水量。
4)要三次重复测定土壤容重：测定出的数值，取算术平均值，绝对误差要＜0．02g／cln3。
土壤容重rs  =(100×g)/[V×(100+W)]
式中rs——土壤容重，   g——环刀内湿土样重量(g)， V——环刀容积(cm3)，
W———土样含水量(％)
2.最大持水量的测定：用100立方厘米的环刀取原状土加盖带回室内放入盛水磁盘（或水盆）中，浸泡约24小时。水面要低与环刀上口2——4毫米，勿使环刀上口进水，同时在同一采土点单取同一层土样，风干后通过18号筛（1mm），装入已用单层纱布包扎好的环刀中，装好后轻轻伯实。然后将盛有湿土的环刀底盖打开，把此环刀连同滤纸一起放在盛有风干土的环刀之上。为使两个环刀接触紧密可压上石块之类。待8小时之后，取原状湿土10一20克放入铝盒立即称重、烘干、称重，反复进行2一3次，取其平均值，即为田间持水量。
田间持水量%=100×（湿土重-烘干土重）/烘干土重
10. 土壤蒸发的测定：人工将Micro—1ysimeter（ PVC管制成，高15cm，内径10cm，表面积 78.5cm2，备有内径稍大、材料相同的外套固定于土壤中，以便将Micro—1ysimeter取出和放回时操作迅速方便。）在每个处理的邻株间（即垄上）和行间（即沟内）从土壤表面按下，将其推入土壤至0.5cm露出地面，然后取出盛有原状十柱的Micro—1ysimeter，削去底部多余的土壤，用聚乙烯胶带封底，然后用感量为1g的电子天平称重。移栽后一个月内每天下午6点称重后更换其内的原状土体重新安排，一月后过3天更换器内土体。降水、涌溉后需要更换土体并做好日期重量等相关记载。
12．大气温湿度：温湿度每日10：00，14：00，18：00记录，雨天降雨前后1小时加测并做好天气记录。
土壤水分的测定
需要说明—点，即在土壤理化分析中，都以“烘干土”作为计算标准，因此，每个实验都有必要测定土壤最大吸湿水含量。
  测定方法与步骤
1.最大吸湿水的测定：在分析天平上称出干燥而洁净的铝盒重量〔W〕，然后放入约5克风干土，盖上盒盖，准确称重(W 1)，再将盖打开放入烘箱中，控制在105℃范围；连续烘干6—8小时，取出铝盒迅速放入干燥器中，冷却至室温(约半小时)，然后取出立即称重（W2）。再放入烘箱中，烘干3—5小时，在干燥器内冷却，再称重，检验是否恒重。实际上只要两次称重不超过3毫克即可进行计算。
2.土壤调萎含水量的测定：：土壤调萎含水量是指植物开始永久凋萎时土壤的含水量。测定方法有两种：一是植物生长实验法，即在一定容器中栽培植物，调控土壤水分，直至植物因缺水而开始永久凋萎时，用烘干法测定此时土壤的含水量即土壤调萎含水量；另一种方法是经验法，即萎含水量％＝土壤最大吸湿水％×2。  
3．土壤毛管持水量的测定：用环刀按土壤剖面层次取原状土，然后将有孔并附滤纸的环刀盖盖好，放入盛有薄层水的磁盘中，保持水深2—3毫米。此时水分受毛管力的作用，沿毛管孔隙上升，浸泡约4—12小时(砂土4小时；粘土8—12小时)，取出环刀，用滤纸擦干环刀外部，放在已知重量的表玻璃上称重，然后再将环刀放回原处吸水至泡和 （砂土2小时；粘土4小时）。如此操作直到恒重为止。将土放入烘箱中，控制在105℃范围烘干，测定含水量，计算毛管持水量。
4.田间持水量的测定：用100立方厘米的环刀取原状土加盖带回室内放入盛水磁盘（或水盆）中，浸泡约24小时。水面要低与环刀上口2——4毫米，勿使环刀上口进水，同时在同一采土点单取同一层土样，风干后通过18号筛（1mm），装入已用单层纱布包扎好的环刀中，装好后轻轻伯实。然后将盛有湿土的环刀底盖打开，把此环刀连同滤纸一起放在盛有风干土的环刀之上。为使两个环刀接触紧密可压上石块之类。待  8小时之后，取原状湿土10一20克放入铝盒立即称重、烘干、称重，反复进行2一3次，取其平均值，即为田间持水量。
结果计算  
  1. 土壤最大吸湿水％＝100*（W1-W2）/（W2-W）
式中 W为铝盒重量〔g〕
W1为铝盒+风干土重〔g〕
W2为铝盒+烘干土重〔g〕
2.土壤毛管持水量%=100*（湿土重-烘干土重）/烘干土重
3. .田间持水量%=100*（湿土重-烘干土重）/烘干土重
设备和器材：环刀 分析天平 铝盒 干燥器 铁夹子 磁盘 铁铲 剖面刀
土壤容重，比重的测定和孔隙度的计算
  测定原理：土壤容重用每立方厘米土壤重克数表示(g／cm3)。测定土壤容重用一定容积的环刀，取一定容积的自然土样，然后称重，按照干土重计算土壤容重。
土壤比重是指土壤颗粒与同体积水(4℃)重量的比值，由于它是指全部土壤颗粒的平均比重，因此，土壤比重的大小与土壤矿物质组成，机机质含量有很大关系。土壤比重是用比重瓶测得的。即将己知重量的土样，放入有水的比重瓶向，排除空气，定容，求出由土壤代换出水的体积。以烘干土重除以体积，  即求得土壤比重。
    测定方法与步骤
1土壤容重的测定——环刀法
1）挖土壤剖面，分层削出横平而：在野外选好剖面点，挖好剖面后，用削面刀修乎，分层确定测土壤容重的层次部位，在取土部位修一横向平面，为环刀取土作好准备工作。
   2)环刀取土方法：将环刀托套在已知重量环刀无刃口的一端，环刀内壁微涂凡士林。环刀刃口朝下，用力均衡地下压环刀托把，将环刀垂直压入土层平面以下。如土层紧实较硬时，可用木锤轻轻敲打环刀托把，待整个环刀全部压入土中，且土面即将触及环刀托的顶部(可由l环刀托盖上的小孔探视)时停止下压。用铁铲把环刀周围土壤挖出，切断环刀下方，并使其下方留有一些多余的十壤。慢慢取出环刀，使它翻转过来，刃口朝上，用削土刀迅速削去附近在环刀壁上的土壤，然后在刃口一端从边缘比中心部位逐渐削平土壤，使之与刃口完全齐平。盖上环刀顶盖，再次翻转环刀，使盖好顶盖的刃口一端朝下，取下环刀托，同样削平无刃口一端的土面，并盖好底盖，注意削平土面时，要细心，否则容易成块脱落，以至因土面不平土样作废。环刀取土后要擦净环刀外粘附的土壤。测湿土重，准确到0．1克，并记录其重量
3) 测.土壤含水量：在环刀采样处另取土样，测定.土壤含水量或直接用环刀内土样测含水量。
4)要三次重复测定土壤容重：测定出的数值，取算术平均值，绝对误差要＜0．02g／cln3。
  2土壤比重的测定
1)        称土：称通过1mm筛孔的风干土样10克，精确到0．001 克。   
2)        装入比重瓶：比重瓶容积为50毫升。   
3)        加蒸馏水：向比重瓶内加蒸馏水，约至比重瓶容积的一半处，徐徐摇动，使土样充分湿润，与水混合均匀。
4)        热：将比重瓶放在沙浴上加热煮沸，并保持1小时，在煮沸过程要经常摇动比重瓶，以驱逐土壤中空气，使土样和水分充分混合均匀。
5)        冷却：从沙浴上取下比重瓶，冷却，再加入预先煮沸过的蒸馏水，加入略低于瓶颈为止，静止澄清。   
6)        定容：冷却澄清后，在比重瓶内继续外加蒸馏水瓶颈，塞好瓶塞，使多余的水从颈孔溢出，用滤纸擦干水分。
7)        称重：要精确列0，00l克。同时要用温度计测瓶内水温，应准确到O．10C。   
8)另称10克风干土样：测定土壤吸湿水含量，准备计算用。
结果计算   
1．土壤容重rs  =(100*g)/[V*(100+W)]
  式中rs——土壤容重，   g——环刀内湿土样重量(g)， V——环刀容积(cm3)，W———土样含水量(％)    2.土壤比重 ds  =g*dwt/(g+g1-g2)
  式中：ds——土壤比重(g／cm3)；  g——烘干土重；   g1———t℃时比重瓶+水重(g)；
        g2——t℃时比重瓶+水重+土样重(g)，  dwt—t℃时蒸馏水比重(g／cm3)。
3.土壤空隙度：指单位容积土体内孔隙所占的百分数。它直接关系到土壤通气和水分状况，土壤空隙度是根据测得的土壤比重、容重经过计算求得的。计算公式：
Pt (%) =(1-rs/ ds)*100
式中：Pt (%) ——土壤孔隙度(％)     rs——土壤容重(g／cm3)； ds——一土壤比重(g／cm3)。
    仪器与试剂：比重瓶（50ml）天平（感量0.001克，0.1克和0.01克） 温度计（±0.10C）电热砂溶 干燥锅 电炉 烧杯（25 ml）取土唤环刀 环刀托 剖面刀 铝盒 凡士林油
土—气界面的水分通量即土壤蒸发的测定  
  —、土—气界面的水分通量
    土壤大气界面上的水分流动过程，是土壤——植物——大气连续体(SPAC)中水流过程的一个环节，定量研究该界面上水分、能量传输及交换，计算通过界面的水流通量密度十分必要。
    (一)土—气界面水分通量的测定
    国内蒸发研究主要集中在农田蒸散与水面蒸发上，积累了许多种实验测定方法和计算方法。测定方法包括大型原状土柱自动称更式蒸发渗漏仪(weighing—1ysimeter)、浮力式水力蒸发器、各种水面蒸发池(皿)等；从微气象角度的研究包括Penman -Monteith综合法、波文比能量平衡法、空气动力学技术多层梯度法、空气动力学阻抗法及涡度相关技术；从水文学角度的研先包括大田水量平衡方法和零通量面法等。然而有关土壤蒸发尤其    是作物棵间蒸发的测定的研究很少，而作物棵间蒸发在农业生产中特别是节水农业中更具实际意义，因此急需发展并研究这方面的直接测定技术。
Micro—1ysimeter是一种用于直接测定裸露土壤及作物冠层下壤蒸发的测定技术，一些研究者对Micro—1ysimeter的内径、深度、使用期限进行了研究。Micro—1ysimeter测得的土壤蒸发与其它方法测得的结果能很好的吻合，这表明Micro—1ysimeter是测定土壤蒸发的一种有效方法，即可用于测定裸土土壤蒸发。Micro—1ysimetcr足一种无扰动的、封底的、可移动的安装于上壤中的原状土柱，以监测水分散失的小型观测器皿。Micro—1ysimeter用PVC管制成，高15cm，内径10cm，表面积 78.5cm2，备有内径稍大、材料相同的外套固定于土壤中，以便将Micro—1ysimeter取出和放回时操作迅速方便。人工将Micro—1ysimeter从土壤表面按下，将其推入土壤至0.5cm露出地面，然后取出盛有原状十柱的Micro—1ysimeter，削去底部多余的土壤，用聚乙烯胶带封底，然后用感量为1g的电子天平称重。1g的变化对面积 78.5cm2的Micro—1ysimeter来说相当于0．127nml的蒸发。称重后，将其放回套简，两次称重之间的重量差即可换算为土壤蒸发。为了保证测定精度．需要使Micro—1ysimeter内部的土壤水分剖面与周围土壤相一致，为了减少由于这种原因造成的误差，裸土或作物生长早期棵间蒸发测定，需要每天更换其内的原状土体。叶面积指数增大后，过3—5天更换器内土体。降水、涌溉后需要更换上体。   
在利用Micro—1ysimeter测定土壤蒸发的同时，在田间设计了不同层次土壤水分动态及作物冠层内能量平不同深度土层土壤含水变异表明，o一20cm土层含水量的变化可基本代表土面蒸发，这样由Micro—1ysimeter测定的土壤蒸发的误差为6．5％。考虑到下层土壤水分的影响，Micro—1ysimeter的使用过程中，经常更换器内土体来保持器内外土壤含水剖面的一致性，使深度较浅的Micro—1ysimeter的测定即方便又可靠 。
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3楼2006-04-18 19:27:31
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wdanying

新虫 (初入文坛)

0.5

有用的,谢
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4楼2006-04-18 20:18:21
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yiluorenjia

金虫 (小有名气)

1

很实用，如果做成附件就更好了
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5楼2006-04-19 13:21:44
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agri521

1

支持
6楼2006-04-19 22:03:47
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blue-eve

金虫 (正式写手)
楼主，你的最大吸湿水测定方法和我的吸湿水测定方法一样，和我的最大吸湿水测定方法不一样，请您确定一下，看是不是笔误，谢谢！
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从今而后，我要活出自我，活出精彩，谢谢wd/yp，617
7楼2006-05-07 19:00:06
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feng_wbj

铁杆木虫 (小有名气)

1

不错
收藏了
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我是一闲人= &世间最珍贵的不是‘得不到’和‘已失去’，而是现在能把握的幸福&
8楼2006-05-09 09:55:56
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lqf808

至尊木虫 (著名写手)

都市农夫

0.5

请问紫色素怎么测?
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9楼2006-05-11 15:11:20
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怪海豚

0.5

10楼2006-09-06 09:20:58
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