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3257197木虫 (正式写手)
森林木虫
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流式细胞术在实验诊断中的应用
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流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计算机技术等学科高度发展、综合的结晶，FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究，为微观认识细胞及横向比较其特征提供了精密、准确的方法和仪器。FCM具有高分辨能力，主要表现在以下五个万面:测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在%2以下；正确分辨二倍体，四倍体、近二倍体及非整倍体，可用于细胞周期分析；利用特配的激光荧光染料进行蛋白质、核酸染色及荧光分析，可以敏感地鉴别细胞上特异性荧光及荧光强度细微的差异；能够选择性地对某群细胞进行分析；尽管对单细胞悬液制备要求严格，但是检测客观、分析细胞数量大、参数多、统计结论可靠。我国自八十年代初引进FCM以来，逐步推广了流式细胞分析术，现就其在实验诊断中的应用概述如下。 1.监测细胞免疫状态 细胞免疫功能不但与恶性肿瘤、免疫系统的疾病有关；而且还与为数众多的受神经内分泌--免疫功能轴影响的状态或疾病有密不可分的联系。因此监测免疫状态如同检查神经和内分泌功能一样重要。流式细胞术提供了简捷地检测淋巴细胞亚群的方法，]993年在波士顿召开的人类白细胞分化抗原会议(leukocyte differentiation antigen，HLDA),将CD抗原(cluster of differentiation)分为T细胞、B细胞、髓细胞、血小板、内皮细胞、自然杀伤细胞、活化抗原、粘附因子、细胞因子和细胞因子受体等九个组，确立了48种新抗原。1996年11月在神户召开的第六届HLDA会议上，又有30多种新抗原被确认，CD编号已达166个，CD抗原有197种。2000年7月，第七届人类白细胞分化抗原会议的召开，CD抗原已达200种。CD系列在免疫学中常被用于  l)CD抗原的基因克隆，新CD抗原及新配体的发现;(2)CD抗原功能与结构的关系;(3)细胞激活途径和膜信号的传递;(4)细胞分化过程中的调控;(5)细胞亚群的功能。美国疾病控制中心 (CDC)于1991年提出将淋巴细胞CD4的绝对值小于200个/μL的人类免疫缺陷病毒 (HlV)感染者列入艾滋病的诊断标准中，即把没有临床症状或临床症状不够原定标准的HIV感染者列入艾滋病病例。CD4细胞的绝对值被用作临床分型的重要依据。吞噬细胞在一定条件下吞噬微球或荧光素标记的金黄色葡萄球菌、酵母菌，应用FCM测定其荧光值即可作吞噬功能试验。用荧光素标记的羊抗人IgG Fab和包被C1q补体的聚苯乙烯微球与血清中的免疫循环复合物作用，根据荧光量的多少可定量测定循环免疫复合物，同样道理也可用Raji细胞法来测定。 2.组织配型与监控移植物的排斥反应 人体脏器移植日益增多，流式细胞术不但提供了组织相容性抗原配型快速反应的测定方法，而且可以随时监测免疫排斥反应，常被用作免疫抑制治疗过程中免疫抑制剂如环孢素的用量与疗程的监控指标。FCM还在各种动物移植模型，各种血液病的骨髓脐带血和自体外周血子代细胞 (PBPC)移植以及IL-2活化的造血干细胞移植等项研究中发挥重要作用。FCM为现代移植医学打开了崭新的一页。从MEDLINE光盘检索获知，仅1997年同时涉及FCM和移植的文献就有117条，FCM在这一领域的应用极为活跃。成功的心脏移植便是利用FCM监视排异状态，及时准确地提供了完整的免疫指标。临床移植免疫学在哪些方面可得益于FCM呢?首先可用来鉴别和定型同种异体反应抗体，通常能极为精确地检出高危的供者和受者(不适合地)匹配;其次通过检测免疫系统的细胞成分及亚型的改变，有助于排异、感染和药物中毒的鉴别诊断;还能够用FCM进行T细胞受体分析以便确定免疫抑制治疗是否适合，有利于移植物受者的生存。多年来，人们建立了许多新的FCM方法应用于临床移植，以下就此作一概述。 (l)检出HLA I类和II类特异性抗体(流式细胞术筛查)。Harmer等人(1993，1998)建立了两个细胞库，每个库含有l0个用EB病毒转化的B细胞系，这20个细胞系基本能代表所有广泛分布的HLA-A和DR抗原及大多数亚类，只有极少数HLA-B和C抗原未包括在内。40ul细胞悬液(5x106/ml)与lOul待检血清在22℃保温3Omin，用含小牛血清及叠氮钠的磷酸缓冲液洗两次并复悬到30ul，加入4ul FITC标记的抗人IgG抗体，置4℃ 3Omin，洗两遍后复悬到5OOul,即用流式细胞仪测定，用阴性对照设门(在阳性门内低于2%);高于本底2%的值为阳性结果。本方法经与传统的补体依赖淋巴细胞毒试验(CDC)及商品化ELISA试剂PRASTAT的结果比较，证明流式细胞术筛查是检测HLA特异性抗体的最灵敏的方法，并且与PRASTAT有明显的正相关。 (2)流式细胞术交叉配型(FCXM)。Garovoy等人(1983)建立本法后，经不断完善，已被广泛采用。日前常用步骤是分离供体淋巴细胞(3xlO5)，加入5Oul受者血清，37℃保温3Omin，用含叠氮钠的PBS洗两遍，加入25ul FITC标记的抗人免疫球蛋白的羊IgG F(ab)2，置4℃ 3Omin(避光),洗两遍后用PBS-AZ复悬至2OOul，用流式细胞仪测定。以未加受者血清的(仅有T细胞与FITC标记物)为阴性对照，荧光道数大于对照2S者为阳性结果。诸多文献证实FCM比标准的CDC检测更为敏感,它不仅能捡出CDC未能检出的阳性结果，而且可在术后比CDC更早检出抗体，因此，它不仅能在移植术前发现高风险的受者，而且能在术后预报移植物的排斥反应。 (3)活化的淋巴细胞亚群测定。移植后用OKT3治疗时每天应计数CD2+和CD3+淋巴细胞。此外利用淋巴细胞的活化标志(HLA-DR)、结合分型标志采用双色荧光可以方便地测出活化的CD8细胞(代表活化的细胞毒性T细胞)和活化的CD16+细胞(代表活化的NK细胞)，在移植后定期观察这两种活化淋巴细胞极为重要，可敏感地预测排斥反应的发生，两者中无论哪一个增高皆意味着排斥反应发生的可能。通常在监测心脏移植病人的排斥反应，以及指导抗排斥的免疫抑制治疗中，可以运用这一方法。 (4)尿液流式细胞术(UFC)。Roberti等人(1995)首先将此用于肾移植后的监测。在分析种采用5Oml新鲜尿液沉淀的细胞。在急性排斥反应 (AR)中，尿沉淀物的所有细胞的HLA-DR表达增高;CD45和CD3仅在AR中增高。在慢性排斥(CR)中，HLA-DR增高的细胞只有25%，而CDl4阳性的细胞则占50%(在AR中只占20%)。因此，UFC被认为能明确地区分AR与其他急性肾移植物功能紊乱。CDl4阳性细胞则可提示CR的存在。本方法甚至能检出亚临床排斥反应，它是评价移植物(肾脏)功能紊乱的有用工具。 (5)测定细胞内巨细胞病毒(CMV)。Imbert Marcille等人(1997)比较了两种细胞固定和低渗处理的方法及7种单克隆抗体，认定IC3、SL2O和NEA-9221能直接用FCM定量测定白细胞内的CMV。Honda等人(1997)采用FCM检出5例骨髓移植受体外周血细胞核内的CMV 极早期(immediate early)抗原，并认为若单核细胞或淋巴细胞内检出了CMV抗原系与CMV的活动或复发有关，而多形核白细胞(PMNLS)中检出CMV抗原，则系CMV相关疾病，如CMV肺炎。 3.血液系统疾病的检查与分型 目前，血液学家不但作骨髓细胞形态分型，而且重视血细胞的免疫分型，这样似乎更能揭示某些恶性增生性疾病，如白血病、淋巴瘤等的细胞学发病机理，提供更为合理的治疗方案，尤其诱导分化方法就是观察其表型改变的。流式细胞术是应用多种单克隆抗体来进行分型的。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的检查对于发现微小残留病变及预测复发具有重要意义。根据免疫表型可将白血病分为急淋(ALL)及非急淋(ANLL)两种，ALL又可分为T系和B系多个亚型，尤其对于M9、M7、ALL及杂合型急性白血病 (HAL)等的诊断具有十分重要的作用。FCM的重要性还在于利用双标记技术进一步区分双克隆或双表型的HAL。急性白血病的多耐药基因(MDR)也常用FCM检测，FCM特有的敏感性和特异性，用于检测二氨基苯茚酮mRNA的表达产物P糖蛋白(P-gp)及其活性(作为药物的排出泵，降低细胞内药物浓度)，可更加直接地反映耐药的程度。 4.FCM在血栓与止血研究中的应用 FCM用于单个或亚群血小板中的血小板糖蛋白(GP)的测定。优于常规的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、对流免疫电泳等方法，因为后几种方法存在较多的问题，如标本用量大，操作复杂，耗时间长，膜纯化过程中有GP的变化，还有血小板亚群的丢失。在评价单个或亚群血小板膜GP的变化方面也优于放射免疫法，而且不易受其他细胞的干扰或由于一个抗原结合多个抗体影响测定效果。常用于诊断巨血小板综合症。FCM也可用于活化血小板的检测。当原来存在于颗粒膜上的GP在质膜上大景表达时，则成为活化血小板的分子标记物，用抗活化血小板的单抗作免疫荧光标记，用FCM测定，为临床评价血小板活化程度提供了早期、特异的诊断指标。 八十年代以来，随着单克隆抗体的发展，流式细胞术(FCM)作为一项新技术以其快速、灵敏、准确、特异的优点已广泛用于临床，能对血小板膜糖蛋白及其功能改变进行检测。大致可分为: (1)血小板膜糖蛋白的测定。既往人们多以SDS-PAGE及免疫印迹等方法测定，操作繁琐，试剂浪费，不适于临床实验室。FCM及血小板GP特异性单抗的应用使血小板膜糖蛋白检测有了新的突破。一定量的全血、PRP或血小板与相应单抗(如522，5221，5222等)孵育30分钟，再加荧光二抗避光30分钟，即可在FCM上直接测定GP的表达率，所需时间、试剂均可大大缩减，为临床诊断血小板无力症(GPIIb-IIIa复合物缺陷)、巨大血小板综合症(GPIb-IX异常)等疾病提供了一种灵敏、简便、快速的方法，同时根据结合率的大小，可判断纯合子或杂合子状态，为家系研究提供帮助。 (2)纤维蛋白原结合试验。正常血小板聚集需要GPIIb-IIla复合物与纤原结合。因此纤原或GPIIb•IIIa上纤原受体的缺陷均可引起血小板聚集障碍而出血。我们应用纤原单抗(如SZ65)及ADP、肾上腺素诱导剂，在FCM上观察纤原结合的百分率及荧光强度，可为该疾病的诊断提供参考依据，使血小板无力症尤其是其变异型(GPIIb•IIla的缺陷)诊断更明确可靠。 (3)vWF结合试验。血小板膜糖蛋白Ib-IX与von Willebrand因子(vWF)结合是血小板粘附的主要条件。临床上vWF的缺乏(血管性血友病)或血小板上GPIb-IX上vWF受体的缺陷(假血管性血友病)均可导致血小板粘附功能不良而引起出血，应用vWF单抗(如SZ29)，辅以瑞斯托霉素、胶原等诱导剂进行vWF结合试验，在FCM上观察结果，可为这类疾病的诊断与鉴别提供依据。 (4)GMPl40(又称P-Selectin)的测定。静息血小板中GMP-140仅分布在α-颗粒膜上，不能被其特异性单抗识别。只有当血小板活化时，α-颗粒莫与胞浆膜融合，GMP-140暴露于膜表面，成为血小板活化的重要指标。临床上许多血栓性疾病，如脑梗塞、脑血栓、心绞痛、心梗、高脂血症等均存在血小板活化。既往测定血浆中PF4、β-TCl等方法灵敏性、特异性欠佳，用FCM检测活化血小板是近年来血栓研究的一项重要技术进展。应用SZ5l等单抗在FCM上直接测得血小板上GMP-140表达率以及反映血小板活化程度较以往方法灵敏、特异。尤其是应用全血法检测使血小板的体外活化大大降低，使血栓性疾病的诊断及预后有了新的方向。 5.细胞DNA定量与细胞周期分析 利用各种内窥镜活检标本、穿刺物、胸腹腔体液及膀胱灌洗液中细胞DNA含量的测定，可以帮助诊断或鉴别诊断良恶性肿瘤。只要发现异倍体细胞，几乎无一例外可被诊断为恶性肿瘤。在消化系统、呼吸系统和泌尿生殖系统的恶性肿瘤中异倍体细胞发生率可达50%以上。此外，在高S期比率和高增殖指数的细胞群体中即使表现为整倍体也常被拟诊为恶性肿瘤，可以进一步作肿瘤标志物来鉴别。对于肿瘤病人的预后判断也与非整倍体、高倍体、高S期比率有关。对于白血病患者的FCM监测可作为化疗缓解、残留微小病灶或复发的指标之一。 6.检测细胞凋亡 FCM检测凋亡的万法有如下几种: （1）形态学检测:凋亡细胞具有特殊的光散射类型 --低前向散射和高侧向散射，可反映细胞体积缩小，胞核/胞质结构改变，但是并不是所有的凋亡细胞都有此类改变。 （2）用荧光染料对降解DNA进行测定:常用的染料有两类，一类是与单体DNA片段结合，如Hoechst33342，4，6二脒基2-苯吲哚(DAPI)及光辉霉素等;另一类是与变性染色质斑块结合，如碘化丙啶(Pl)、溴化乙啶(EB)、丫啶橙 (AO)。在细胞周期中表现为亚二倍体的凋亡细胞峰，但是有一定的漏检率。 （3）标记法:标记DNA断裂的3-羟基末端，常采用由DNA聚合酶1催化的原位缺口转移(in situ nick translation,ISNT)或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)技术，ISNT和TUNEL法均可进行间接或直接标记，前者的标记物通常是生物素化脱氧三磷酸尿苷 (biotin-dUTP)或地高辛配体(Dig)-dUTP等;后者的标记物常为异硫氰酸荧光素(FITC)- dUTP。间接标记还需链霉亲合素 (FITC)或抗 Dig-FITC，使标记反应倍增，其灵敏度较高，但比直接标记复杂。标记法的优点是:观测细胞数量大，避免由于细胞过少导致的偏差;设立阴性对照，能较客观地检测凋亡细胞群体(光镜检查是凭主观判断);较容易进行凋亡与其他相关因素的联合检测;且较病理学检测相对而言用时短、简便。 7.检测细胞特异性标记物 FCM不但可以定性分析标记物，而且可以进行定量。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原决定簇的个数。细胞表面受体，如低密度脂蛋白受体、淋巴因子受体、干扰素受体、白细胞介素受体等的定量分析，在冠心病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的临床应用也相当广泛。细胞内的受体，如雌激素受体、糖皮质激素受体的检测，对于乳腺癌的性激素治疗和糖皮质激素的治疗也有一定的意义。 |
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