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3257197木虫 (正式写手)
森林木虫
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原位聚合酶链式反应原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程
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原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程 （一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。 （二）、操作流程 1、原位PCR步骤 1）预处理： （1）切片常规脱蜡； （2）0.2mol/L HCl处理10min； （3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min； （4）Nase消化组织37℃ 30min； （5）梯度酒精脱水，室温干燥。 2）原位扩增： （1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边； （2）PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30个循环，72℃延伸10min； （3）氯仿洗去盖玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。 3) 原位杂交： （1）加地高辛标记探针的杂交液，98℃变性10min，-20℃退火5min，42℃杂交过夜。 （2）杂交后用2×SSC洗涤10min，3次，1×SSC洗涤10min，3次； （3）缓冲液洗涤10min，3次； （4）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h； （5）缓冲液洗涤5min，3次； （6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。 （7）常规脱水：透明、封固。 2、原位RT-PCR步骤 1）预处理： （1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸馏水洗； （2）95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。 2）原位扩增： （1）在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应； （2）用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min。再将热循环仪设定为95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循环； （3）扩增结束后，在80℃烤15min～30min。 3）原位杂交： （1）杂交前标本95℃加热3min； （2）加上杂交液，湿盒内50℃过夜； 杂交液组成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA， 每0．5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。 （3）扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。 3、荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）操作规程 仪器设备 1、 医用微波炉； 2、 水浴锅； 3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂 （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃； （2）20×SSC（pH7.0）； （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)： 4ml 20×SSC； 8ml蒸馏水； 28ml甲酰胺。 每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml； 蒸馏水16ml； 甲酰胺20ml。 每次新鲜配制。调节pH前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测： 9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。 10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min； 11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。 扩增： 12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min； 14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min； 15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min； 17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。 5、细胞核染色： 1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml； 2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。 PRINS步骤 1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS； 2、用0.2mol/L盐酸处理5min； 3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min； 4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片； 5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片； 6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min； 7、用0.1×SSC液，65℃洗5min； 8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次； 9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min； 10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h； 11、BufferⅢ液洗5min； 12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色； 13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。 免疫组化问题及解决办法 1、染色过强 原因 解决办法 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间： 室温1小时或4℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃ DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准 2、非特异性背景染色 原因 解决办法 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 组织中含内源性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 3、染色弱 原因 解决办法 抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟 试剂超过有效使用期 及时更换试剂 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜） 蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟 4、染色阴性 原因 解决办法 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误 |
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