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木虫 (正式写手)

森林木虫

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[交流] 原位聚合酶链式反应原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程

原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程
  （一）、仪器设备英国Thermo Hybaid原位PCR仪。
  （二）、操作流程
  1、原位PCR步骤
1）预处理：
（1）切片常规脱蜡；
（2）0.2mol/L HCl处理10min；
（3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；
（4）Nase消化组织37℃ 30min；
（5）梯度酒精脱水，室温干燥。
2）原位扩增：
（1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；
（2）PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30个循环，72℃延伸10min；
（3）氯仿洗去盖玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。
3) 原位杂交：
（1）加地高辛标记探针的杂交液，98℃变性10min，-20℃退火5min，42℃杂交过夜。
（2）杂交后用2×SSC洗涤10min，3次，1×SSC洗涤10min，3次；
（3）缓冲液洗涤10min，3次；
（4）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h；
（5）缓冲液洗涤5min，3次；
（6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。
（7）常规脱水：透明、封固。
  2、原位RT-PCR步骤
1）预处理：
（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸馏水洗；
（2）95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。
2）原位扩增：
（1）在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；
（2）用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min。再将热循环仪设定为95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循环；
（3）扩增结束后，在80℃烤15min～30min。
3）原位杂交：
（1）杂交前标本95℃加热3min；
（2）加上杂交液，湿盒内50℃过夜；
杂交液组成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA，每0．5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。
（3）扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。
  3、荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）操作规程
仪器设备
1、医用微波炉；
2、水浴锅；
3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；
4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。
  FISH试剂
（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；
（2）20×SSC（pH7.0）；
（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；
（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：
4ml 20×SSC；
8ml蒸馏水；
28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：
20×SSC 4ml；
蒸馏水16ml；
甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。调节pH前升至室温。
  实验步骤
1、脱蜡：
1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2）100％酒精两次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：
1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
5）空气干燥。
4、杂交：
1）准备探针；
2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：
5）镊子小心去除盖玻片；
6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：
9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：
12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
  PRINS步骤
1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；
2、用0.2mol/L盐酸处理5min；
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；
4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；
5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；
6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；
7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；
9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；
10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；
11、BufferⅢ液洗5min；
12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；
13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。

免疫组化问题及解决办法
1、染色过强
原因  解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：          室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃    一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因  解决办法
操作过程中冲洗不充分    每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性生物素    正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分       延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因    解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短    提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期          及时更换试剂
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃  若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度                封闭时间不要超过10分钟
4、染色阴性
原因  解决办法
操作步骤错误          重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原          设立阳性对照片，以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误  仔细确定一抗与二抗种属无误

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