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血与泪的RNA抽提抽提经验
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对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？ 组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法响应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质 – 用嘴碾磨，肠胃抽提。 究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。 (go top) 实验前方法/试剂的选择 0：抽提 RNA 的目的 RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财。 1：样品的收集/保存 – 影响降解的因素 样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。 2：样品的破碎及匀浆 – 影响降解和得率的因素 样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。 3：裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素 常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。 4：纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留。抽提速度的因素 对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。 (go top) 问题解答 (外源性污染导致的问题不在本解答考虑中。防止外源性污染的办法见 ‘Rnase 污染的10大来源’) RNA 的降解 理论上 28S:18S = 2.7:1，实践中达到该比值几乎没有可能，并且没有必要。降解的标志是：28S:18S < 1。下面是最常见的导致 RNA 降解的原因及正确的做法： 新鲜细胞：如果试剂没有问题，外源性污染也可以排除的话，降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞的话，一定要使裂解液能盖住细胞。 新鲜组织：某些富含内源酶的样品 (如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免 RNA 的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。这些样品使用玻璃匀浆器匀浆更不可靠。 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至 – 70C 冰箱保存。样品要相对小一点。样品决不能不经液氮速冻而直接保存于 –70C 冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下碾磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA 比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以碾磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品碾碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 A260 /A280 比值低 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机项。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法是用 PCI 重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机项。加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法是再沉淀一次后，溶解。 设备限制：测定 A260 及 A280 数值时，要使 A260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。 A260 /A230 比值低 抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。解决办法是再沉淀一次后，溶解。 组织内杂质残留：一般为多糖类杂质。解决办法是改用其它办法，如 LiCl 沉淀。 设备限制：测定 A260 及 A280 数值时，要使 A260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 奇怪的电泳带型 非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。使用 2ug 上样量，电压小于 6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以 DNA 标准为参照，28S 和 18S 分别位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。) 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。 下游实验效果不佳 RNA 降解：见上面。 抽提试剂的残留：加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。75% 乙醇洗涤时，一定要使核酸沉淀悬浮起来。更好的是使用两次洗涤，并且在倒掉第二次洗涤液后，再将离心管放入离心机中，离心数秒后，用移液器将残留的乙醇小心吸掉。 样品中杂质的残留：从富含多糖等杂质的样品中抽提 RNA 时，多糖往往同核酸一起被沉淀下来。用水溶解核酸时，发现有一些粉末状不溶物，往往就是多糖。高速离心后，将上清移入另外一个离心管中，再次沉淀核酸，可以减少这些杂质。更好的是使用有针对性的纯化方法。 DNA 污染：在 RNA 抽提操作中，少量 DNA 的污染是正常的，且对大部分下游实验没有大的影响。降低样品起始量或者增加溶液使用量，能将 DNA 的污染降低到电泳看不见的水平。能够彻底去除污染 DNA 的方法只有用 RNase-Free 的 DNase I 消化抽提的 RNA。残留的 DNA 是否影响后续实验，可以用下面的实验检测：以抽提好的 RNA 做模板进行 PCR 扩增：如果不出现目的条带，DNA 的残留无须去除，否则要使用 Dnase I 消化，或者重新试剂引物。 |
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