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实验动物的生理、生化、免疫、血液学等各项指标的检测方法！
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能到本版来的各位战友相信都做过动物试验，也检测过实验动物的指标，希望各位战友能将自己检测实验动物的各种指标时所使用的方法拿出来与大家分享。 二．红细胞计数： 动物红细胞计数可用普通的血细胞计数器，也可用光电比浊法。 （一）计数方法（试管法） 1．用清洁干燥的微量血红蛋白吸管吸取动物末梢静脉血20mm3，擦去管尖端外部的余血。 2．迅速挤入盛有4ml红细胞稀释液的华氏小试管中摇匀，此时血液的稀释倍数为1／200。 3．将稀释液滴入计数池，静置3分钟，在高倍镜下数中央大方格中的5个中方格，将5个方格计数的红细胞数相加。 4．计算：5格的总和×1／50mm3（5个中格的体积）×1／200（稀释倍数）＝1／10000mm3。 故5格的总和×10000即为每1／2 mm3 内的红细胞数。 （二）红细胞稀释液的配制 1．配方一： 氯化钠 0.8g 蒸馏水 1000ml 2．配方二： 氯化钠 9g 重碳酸钠 1g 蒸馏水夹至 1000ml 三．白细胞计数： （一）计数方法 与红细胞计数一样，可用普通的血细胞计数器，也可用电子血细胞计数机计数。 1．用清洁干燥的微量血红蛋白吸管吸取动物末梢静脉血20mm3，擦去管尖端外部的余血。 2．立即挤入盛有0.4ml白细胞稀释液的小试管内，充分摇匀。 3．将混悬液滴1小滴入计数池。 4．静置3分钟，待白细胞下沉后，在低倍镜下数四角4个大方格的白细胞数。 5．计算：4个大方格的体积为4／10mm3，血液稀释倍数为20倍。故4格白细胞数的总和×4／10×1／20=1／50mm3，4格白细胞总数×50=lmm3的白细胞总数。 （二）白细胞稀释液的配方 冰醋酸(纯) 200ml 蒸馏水加至 1 000ml 稀释液内加入少许结晶紫或美蓝，呈浅紫色，以资识别，并可使白细胞更明显。 四．白细胞分类计数 （一）计数方法 1．采血：常法取动物末梢静脉血滴于载玻片的一端。 2．取1片边缘光滑平整的玻片作推片，先放血滴前方，两者成30～35°角，将推片稍向后拉，并左右移动使血滴形成一线，粘着推片边缘。 3．将推片由1端向另1端平稳地推进，用力须均匀，直至血液推尽为止。推片角度的大小可控制血片的厚薄，角度大、移动快则血片厚，相反则血片薄。应移动稍快不加压力将血液推成薄膜。 4．将推好的血片置于空气中完全干燥。一般良好的血片应有头、体、尾3部分，血膜开始端较厚，末端较薄，玻片两侧及两端都有适当空余部位。 5．染色：将血片需染的部分两端用蜡或蜡笔画一线，防止染液流出。把血片放在染色架上或平台上，滴瑞氏染液5—7滴，盖满整个血膜，l min后加等量磷酸缓冲液。在常温下染色l0min，用水冲洗。将染好的血片直立于空气中，待镜检。 6．计数：先在低倍镜下全面观察已染血片，可略知细胞分布情况、染色好坏，以及对白细胞总数作出初步估计。选择血片厚薄均匀，在血片体、尾部之间，转换油镜下数满100—200个白细胞。一般白细胞总数在10 000左右数100个，10 000以上数200个。将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞分别记录在血细胞分类计数器上，求出百分率。 l张染色好的血片，在显微镜下红细胞呈橘红色，中央色淡；白细胞核呈紫红色，嗜中性粒细胞呈浅红紫色或粉红色；嗜酸性粒细胞呈亮红色；嗜碱性粒细胞呈暗紫色；淋巴细胞浆呈浅蓝色；单核细胞浆呈极浅蓝色。 （二）染液和缓冲液的配置 1．染液的配置： 瑞氏染粉 0.1g 中性甘油 3ml 甲醇 60ml 配法：准确称取瑞氏染粉，放入洁净研钵中研细。加入中性甘油再研，加入少量甲醇再研。将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，再加入少量甲醇研磨，如此直至染料全部溶解，加甲醇至需配置容量。混匀后置棕色瓶中保存，用前过滤。一般配置后在常温下保存一周即可使用。 2．缓冲液配置（pH6.4）： 10％无水磷酸二氢钾 30ml 10％无水磷酸氢二钠 20ml 蒸馏水加至 1000ml 五．血小板计数： （一）计数方法 1．小试管内加血小板稀释液0.4ml。取动物静脉血20mm3，迅速挤于稀释液内，立即充分摇匀。 2．放置4—10min，待溶液呈透明红色，说明红细胞已经充分溶解，充分摇匀，取1小滴加入计数池。 3．放置10－15min，待血小板完全下沉后，先将中央大方格移至低倍镜视野内，再转以高倍镜，数5个中方格内的血小板数。 4．血小板大小形态不一致，但均呈折光的发亮淡蓝色小点，大小约红细胞的1／7—1／2，呈不规则圆形或长圆形。在计数时必须来回扭动显微镜微调，不要遗漏计数。 5．计算：5个中方格血小板总和×1／50mm3(5个中方格的体积)×1／20(稀释倍数)=1／1 000mm3。 故5个中方格的总和×1 000=l mm3血液的血小板数。 （二）血小板稀释液的配置 1．配方一：尿素稀释液： 尿素 1.3g 枸橼酸钠 0.5g 甲醛 0.1ml 蒸馏水加至 100ml 将尿素、枸橼酸钠溶于蒸馏水中，然后加入甲醛。为方便观察，可加入少许美蓝，放冰箱保存，用前必须过滤。 2．配方二：1％草酸铵稀释液： 草酸铵 1g 蒸馏水加至 100ml 六．网织红细胞计数 （一）计数方法 1．在小试管中滴加1滴煌焦油蓝生理盐水溶液，再加入末稍血 2滴，充分混合均匀。 2．静置15～20分钟后，取1滴制成薄片。 3．油镜下检查1000个红细胞中的网织红细胞数，以百分率表示。 网织红细胞绝对值计算：网织红细胞数／μ1＝（网织红细胞％×红细胞数／μ1）/100 （二）煌焦油蓝生理盐水溶液配制： 煌焦白蓝 1g 枸橼酸钠 0.4g 氯化钠 0.85g 蒸馏水加至 100ml 过滤后备用 七．骨髓细胞计数： 将小鼠颈椎脱位处死，取l根股骨，用10ml 3％醋酸溶液冲出骨髓细胞，在血细胞计数器上计数4个大方格的细胞数，所得细胞数乘以2．5 x 100 000，即为1根股骨中骨髓有核细胞数。2.5 × 100 000表示稀释倍数。 4个大方格的体积为0.4mm3，而1000mm3＝l mL，现稀释成10mL，所以乘2.5 × 100 000。 八．红细胞比积及红细胞沉降率的测定 （一）红细胞比积的测定 1．温氏管法：静脉采血2ml，注入抗凝管中，充分混匀，再用细长毛细滴管吸取混匀的抗凝血，插入红细胞比积管底部，然后将血液缓慢注入至刻度“10”处，水平离心机以3000rpm离心30分钟，读取红细胞层柱高的毫米数。再离心10分钟，至红细胞不再下降为止，乘以0.01，即为每升血液中红细胞体积（L/L）。 2．毛细管法：使用虹吸法取外周血充进毛细管内，把毛细管的一端插入橡皮泥中，封口，高速离心机12000rpm 5分钟，测量血液总长度和红细胞长度，计算红细胞所占百分率。即为红细胞比积。 （二）红细胞沉降率的测定 取直径为3mm的试管1支，加入抗凝剂0.4m1，常规静脉采血后，将血加入试管至2ml，混匀，用血沉管吸取上述混匀血液至“0”刻度处。将管直立在血沉架上，室温静置l小时。观察血浆高度，红细胞下沉的毫米数即为结果。 在测定红细胞沉降率时应注意：标本采集时要避免脂肪血；血液和抗凝剂比例要准确；放置要垂直；做血沉的标本要在采集后3h内测定，并充分混匀；血沉应在18～25℃室内测定。 临床血液流变学检测指标规范化的研讨 中国医学科学院血液学研究所 李贵山 临床血液流变学检测指标规范化建议的综述 目前对血液流变学检测指标规范化的建议可概括为：血液标本的采集、检测指标的确定、应用仪器的选择、检测结果的表述等四个方面，综述如下： 一、 血液标本的采集 1、 采血：取坐位，清晨空腹安静状态下采集肘前静脉血。采血时应尽量缩短压脉带的压迫时间，针头刺入血管后立即松开压脉带，安静约5秒后开始采血。最好用7号以上的针头，采血过程不宜过快，以避免针头处产生过大的剪应力从而破坏红细胞的流变特征。溶血问题也应引起注意。 2、 抗凝：抗凝剂对血液流变特征的影响不可忽视。建议使用肝素或乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝，肝素抗凝浓度20～30IU/ml全血，EDTA为3.4～4.8mmol/L全血。用固相或高浓度液相抗凝剂，如用液相抗凝剂应放在干燥玻璃管或玻璃瓶，在烤箱中烘干后使用，烘干温度控制在不超过56℃。将静脉血注入抗凝管时应先取下针头，将血液沿管壁缓慢注下，血液注入后要摇匀，使血液与抗凝剂充分混匀，注意避免剧烈震动，以免造成溶血。如直接使用液态抗凝剂如枸橼酸钠、EDTA等应考虑其对血液的稀释作用。同一批试验应采用同批号同种抗凝剂。 3、 保存：血液样品应随采随测。血液采集后20min测量，一般应在采集后4h以内完成测定。血样放置应在室温下（18～25℃）密封保存，不宜放入冰箱，否则将影响血液的生理状态和流变特征。特殊情况血样必须延长存放时间时应将血样放入4℃冰箱中，保存时间一般不超过12h。存放血样在测量前要充分摇匀，在结果报告中应注明保存条件。 4、 血浆制备：血浆制备采用临床常规方法，离心力2300g左右，离心30min，提取上层血浆测量血浆粘度。 5、 测量温度：血液粘度计应有恒温系统。血样和样品池都应控制在[(37±0.5)℃]测定血液表观粘度。特殊情况在其他温度下测定时，应在报告中注明温度。 二、 血液表观粘度的测定 1、 粘度计的选择：血液流变学检测仪器如血液粘度计、红细胞变型仪、红细胞聚集仪等，必须符合2000年1月4日国务院公布的《医疗器械监督管理条例》。血液粘度计建议选用剪切流场均匀、剪变率确定的旋转式粘度计，如锥板式粘度计，它的设计原理保证了血样在样品池中承受均匀的剪应力作用。选购血液粘度计应进行准确度、分辨率、重复性复验。 （1） 准确度：指所测数值与真值（给定值）符合的程度。复验测定时应以国家计量标准油为准，在剪变率1～200s-1范围内分别用低粘度油(约2mpa.s)和高粘度油(约20mpa.s)测定其粘度值,各测定5次以上。要求测定值与真值的相对偏差不大于3%； （2） 分辨率：对血液表观粘度而言，分辨率是指粘度计所能识别出的血液表观粘度最小变化量。影响血液表观粘度的因素很多，一般以压积的变化反映仪器的分辨率。取压积在0.40～0.45范围内的正常人全血，以自身血浆调节压积的变化。在高剪变率（200S-1）,仪器应能反映出压积变化0.02时血液表观粘度的变化，在低剪变率（1s-1），仪器应能反映出压积变化0.01时的血液表观粘度的变化。上述测量应各测定5次以上； （3） 重复性：系指多次测量同一指标时所测数值的重复程度，取同一血样，压积在0.40～0.45范围内，按照仪器操作规程测量10次。在高剪变率（200S-1）时血液表观粘度的变异系数应小于3％，在低剪变率（1s-1）时血液表观粘度的变异系数应小于5％。 为反映血液的流变特性，粘度计应能提供不同的剪变率。建议测量血液表观粘度的剪变率在1～200S-1之间。测定时应严格控制加样量，血样用量多少都将影响测量结果。应使用定量移液管或加样器，移入时不要产生气泡。 为保证仪器的测量精度和正常工作，建议粘度计测量的准确度、分辨率和重复性应至少每半年复检1次。 2、 测定要求：血液表观粘度测定按剪变率由高到低的顺序，当高剪变率下到稳定读数之后，尽可能快速进行低剪变率下的粘度测定。由于红细胞聚集和沉降作用影响，低剪变率下读数表现随时间延长而下降，此时应采用峰值处的读数来计算低剪变率下血液表观粘度。每次测定时样品池都应清洗干燥，血样及测量系统应保持恒温。 3、 正常值：血液表观粘度是血液流变特性的主要参数，其正常值是根据地区、人群、性别、年龄等因素来确定的统计学数值，不是固定的物理量。当测定值与正常值之差（绝对值）大于2倍正常值标准差时，可以认为是血液粘度异常。由于人的个体差异、地区差异、仪器差异等原因，各地区都应有自己的正常值。正常值应按男女、年龄等合理分组。 三、 红细胞压积的测定 测定红细胞压积时应控制离心力大小和离心时间。 1、 温氏法：选用水平离心机，离心力为2300g，离心30分钟。选定离心机半径和转速时，可按下列公式计算离心力值： RCF＝11.18×10-6×N2×R 如离心机半径R为20cm，转速N为3100r/min。则 RCF＝11.18×10-6×（3100）2×20＝2268g 2、微量毛细管法：选用内径约0.8mm长约75mm均匀光滑的毛细玻璃管，吸入抗凝血30ul,约占管长的3/4处。封好底口，以高转（12000r/min）平板离心机离心，离心力为15000g，离心5分钟。 微量毛细管法所测结果较温氏法约低2.8％。 四、 血浆粘度的测定 血浆为牛顿流体，在刚性均匀圆直管中做定常流动时符合伯素叶定律。建议选用玻璃毛细管粘度计测量血浆粘度。毛细管内径应小于0.5mm。管长与内径比大于200，内径均匀，内壁光滑。粘度计应标明毛细管内径和标定值t0(温度在37℃时蒸馏水的测定时间)。复查其准确度时可用蒸馏水在相同温度下测得的时间比D＝（t—t0）/t0表示，D≤1％。也可选用合格的锥板粘度计来测定血浆粘度，但对比测定时也应采用同种仪器。 五、红细胞变形性的测定 临床常用的测定红细胞变形性方法主要有激光衍射法、微孔滤膜法和粘度测量法等。 1. 激光衍射法： （1） 激光衍射红细胞变形仪的选择：红细胞变形性是指红细胞在外力作用下改变其形状的能力。红细胞在剪切场中被拉伸成椭圆形状按流动方向取向，形成流场中的一致排列。通过用激光束照射红细胞悬浮液的流场，可以得到红细胞变形后叠加的衍射图像，其衍射图为旋转90°的椭圆环，环的椭圆度与红细胞的变形情况成正相关。红细胞悬浮液可用低分子右旋糖苷或聚乙烯吡咯烷酮配置。红细胞变形仪要能提供稳定的大小确定的剪变率、功率稳定的激光及完善的衍射图记录装置，最好同时配有图象分析装置。变形仪重复性的变异系数应小于3%。 （2） 红细胞悬浮液：低分子右旋糖苷悬浮液，25%的4万分子量低分子右旋糖苷溶液，加入电解质，使最终溶液中含有NaCl (0.12mol/L)，Na2HPO4·12H2O(0.02mol/L)，KH2PO4(0.05mol/L)，最后将pH值调至7.40±0.05，通过NaCl用量的调节使悬浮液渗透压保持在（295±5）mOsm/L。使用时用20μl抗凝全血与4ml悬浮液混合摇匀，测量红细胞变形性。测量温度为37℃。聚乙烯吡咯烷酮悬浮液：PVP（聚乙烯吡咯烷酮，3万单位）15g，Na2HPO4·12H2O(1g)，KH2PO4(68mg)，NaCl(280mg),将上述物质溶于100ml蒸馏水中，将pH调至7.40±0.05，通过NaCl用量的调节使悬浮液渗透压保持在（295±5）mOsm/L。测量时用40μl全血与1ml悬浮液混匀后使用。 悬浮液粘度控制在一定范围，在37℃时为（14.0±0.3）mPa.s。上述参数在实验中应保持恒定。检验缓冲液是否对红细胞形态造成影响的最直观方法是在显镜下观察悬浮液中的红细胞形状是否为双凹圆盘状。如果有条件应该在每批悬浮液配好后都检测红细胞形态。 作出激光衍射图后利用计算机图象处理方法计算出红细胞变形指数。 2. 微孔滤膜法： （1） 微孔滤膜红细胞变形仪的选择：微孔滤膜红细胞变形仪是通过测量在一定的正压或负压下红细胞悬浮液通过一定孔径的微孔滤膜的时间或红细胞悬浮液通过滤膜的压力-流量关系，以此来反映红细胞的变形能力。微孔滤膜的孔径、厚度及均一性对仪器影响最大，滤膜孔径一般有3μm和5μm两种，以3μm孔径的滤膜应用广泛。微孔在滤膜上应分布均匀、孔径一致、重孔率小于3%，孔的密度为（4～5）×105/cm2，厚度为10μm以下。要求在电镜或高倍显微下观察孔径，超过50%的微孔直径符合要求才能使用，微孔边缘要光滑，不能有毛刺。此外，仪器应能提供稳定、大小可调的正压或负压。同批实验应用同一批号滤膜。 （2） 微孔滤膜法的测定：可用红细胞滤过指数（EFR）或红细胞变形指数（DI）来表示红细胞变形性。测定时应先用（0.2～0.4）μm孔径的滤膜对配制好的悬浮液进行过滤，除去污染微粒，过滤后的悬浮液使用期不超过1周。用配好的悬浮液清洗两次红细胞，再用离心法（1850g离心10min）或棉花过滤法滤除白细胞，使白细胞数量低于25个/mm3。配好的红细胞悬浮液压积应为5%～10%，实际测定中常用7%压积，并且要求压积要恒定。 （3） 测量的影响因素主要有： ① 红细胞悬浮液的渗透压； ② 红细胞悬浮液的pH值； ③ 实验室温度，一般以25～30℃为宜； ④ 红细胞悬浮液中红细胞的浓度； ⑤ 微孔筛的孔径、厚度及均一性； ⑥ 正压或负压值等。临床上可采用控制滤过时间、正压或负压值，测定红细胞滤过率来表示红细胞变形性。 3. 粘度测量法： 在没有上述仪器时也可采用粘度测量法间接了解红细胞变形性。一般认为高剪变率下的全血粘度与红细胞的变形能力有关，与之相应的是红细胞刚性指数（Tk）值。用旋转式粘度计测量同一剪变率（100s-1或200 s-1）下的全血粘度ηb和血浆粘度ηp，然后按下式计算红细胞刚性指数： 正常的红细胞Tk值<0.9，病理状态下的红细胞Tk值>1。 4. 粘度换算法:用测定的高剪变率下血液粘度值（ηb）与血浆粘度值（ηp）和红细胞压积Hct换算红细胞刚性指数IR |
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