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cocofeifei

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】怎样创建植物组织培养的无菌环境已有19人参与

刚刚开始研究生阶段的研究，然后老板让做一个完全的方向的研究。植物组织培养是研究的基础，由于本人本科阶段是做化工的，所以没有任何基础。现在想要问各位筒子一个问题，就是无菌环境的创造，我先说一下我知道的哈：
1、培养基培养皿高温蒸汽灭菌。
2、超净台紫外灭菌30min，这时候要把不怕被紫外伤害的所有物品全部放入超净工作台灭菌。
3、把待培养的植物材料外喷75%的酒精后放入超净台，手也要喷酒精才能进入超净台工作。
4、要一直开无菌空气扇。
问题是：如果我的植物材料是用封口膜封上的，那进喷酒精可以杀菌吗？因为封口膜两层塑料之间也会有细菌存在的啊！

还有就是，在配置固体培养基的时候，灭完菌后，要把培养基摇一摇再让其冷却吗？

操作的时候手不允许在任何敞口容器上方经过，但是经过真的很容易染菌吗？

请大家不吝赐教！谢谢！！

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1楼 2010-07-29 19:20:34

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hzau2000zht

金虫 (小有名气)

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无菌操作
植物组织培养要求严格的无菌条件及无菌操作技术。无菌操作技术如下。
一、接种室的无菌技术
无菌操作室或接种室除用甲醛和高锰酸钾按2比1的比例定期熏蒸灭菌，在实验室用甲醛和高锰酸钾封闭消毒期间，不宜进入消毒空间(我们公司现在是用臭氧)。消毒后通风换气，等气味散尽后再出入。使用前用20%新洁尔灭（苯扎溴铵溶液）对接种室内墙壁、地板及设备擦洗，用75%酒精喷雾（使灰尘迅速沉降），用紫外线灭菌20分钟或更长，照射期间注意接种室的门要关严。当接种室在用紫外线消毒期间，工作人员不要处在正消毒的空间内，更不要用眼睛注视紫外灯，也要避免手长时间在开着紫外灯的超净工作台内进行操作。一般在接种室用紫外线消毒后，不要立即进入接种室，此时室内充满高浓度的臭氧，会对人体，尤其是呼吸系统造成伤害。应在关闭紫外线灯15~20分钟后再进入室内。
二、工作人员的无菌技术
工作人员要经常洗头、洗澡、剪指甲，保持个人清洁卫生。在接种室穿医护用的特制工作衣帽。工作衣、帽、口罩也要经常清洗，洗净晾干后用纸包好进行高温高压消毒。工作衣使用前后挂于预备间，并用紫外线照射灭菌。接种前洗手，最好用肥皂水或新洁尔灭清洗，然后用75%酒精擦洗或喷洒。
三、接种器械无菌技术
接种时首先要用紫外线照射超净工作台面后，用75%酒精喷雾或擦洗工作台面。工作前送风15~30分钟左右。首先对器械支架进行灼烧消毒，然后对接种工具如手术剪、手术刀、镊子等进行灼烧消毒，方法一般是用75%酒精浸渍、擦拭或喷洒后在酒精灯上灼烧。接种工具灼烧后放在器械支架上冷却待用。接种一定数量材料后，接种器械要重新灼烧灭菌，避免因沾有植物材料或琼脂等引起双重污染和交叉污染。通常采用两套接种工具，使用一套时，另一套灼烧后冷却。对于较大的器械如显微镜等，可用75%酒精擦洗表面，然后用紫外线照射灭菌。继代转接时，要注意对待转接的培养物进行仔细观察挑选，防止将已经污染的培养物继代扩增；放置了很久的试管或三角瓶表面和瓶塞宜用75%酒精绵擦洗。接种器械灼烧时应远离装酒精的容器，更不能刚刚烧完就插入装酒精的容器中，也要避免不小心将酒精容器或酒精灯碰倒后引起失火。另外，在酒精灯点燃后，不宜用酒精溶液喷洒超净工作台。
四、接种操作无菌技术
接种时，要穿好工作衣，戴好工作帽和口罩，不准说话或对着植物材料或培养容器口呼吸。打开包塞纸和瓶塞时注意不要污染瓶口。在近酒精灯火焰处打开培养瓶瓶口，并使培养瓶倾斜，以免微生物落入瓶内。瓶口可以在拔塞后或盖前灼烧灭菌，接种工作宜在近火焰处进行。手不能接触接种器械的前半部分（即直接切割植物材料的部分），接种操作时（包括拧开或拧上培养瓶盖时），培养瓶、试管或三角瓶宜水平放置或倾斜一定角度（45°以下），避免直立放置而增大污染机会（图1）。手和手臂应避免在培养基植物材料、接种器械上方经过。已消毒的植物材料接种时不慎掉在超净工作台上，不宜再用。接种期间如遇停电等事件使工超净工作台停止运转，重新启动时应对接种器械及暴露的植物材料重新消毒。
切割外植体时，可在预先经消毒（高温高压消毒、干热消毒或洒精擦拭后灼烧灭菌）后的培养皿、盘、碟、玻璃板、滤纸、牛皮纸或纸箱皮等上进行。如果需要将组织切割成大小或重量均匀的小片（块）时，可以使用塑料包裹或玻璃覆盖的绘图纸、软木打孔器、以及在铝箔纸上利用天平无菌称量等。在解剖茎尖或分生组织时，动作要快而准确，避免材料损伤过多或在空气中暴露过久而褐化或干死。