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benjamin123

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[交流] EMSA PROMEGA FAO01

4．NF-kB：NF-kB最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-kB和IkB的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49（也可称为p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75单体起反式激活作用。p50，p49（p52）单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应（14）。p49和p50也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作NF-kB的凝胶迁移实验时，在20ul的反应体积中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49，p50，p65的细胞中，可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。下列试剂可加强NF-kB在体外的结合：mM的GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子，ng的Co+3(NH3)6（12）。
5．OCT1：OCT1是OCT转录调节因子家簇中的一员，显然在哺乳细胞中存在比较广泛（5）。POU结构域包括POU-box和Homeo结构域。当用HeLa细胞核抽提物时，可检测到一个与OCT1同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。
6．SP1：SP1是一个O-糖基化的转录调节因子，它识别10个核苷酸长度的同源序列5`-GGGGCGGGGC-3`（1）。核心识别序列是5`-GGGGCGGG-3`。同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40的早期启动子就是一个例子，它是第一个可以结合SP1的启动子。根据糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa细胞核抽提物与SP1同源探针形成特异的凝胶迁移复合物。
7．TFIID/TFIIB：TFIID和TFIIB是基本的转录调节因子，参与RNA聚合酶II启动子的基本的转录（16）。TFIID与真核启动子的TATA区域形成特异的DNA结合。TFIID由几个蛋白组成，而其中的TATA区域结合蛋白（TBP），参与TATA序列的结合。TFIID的其他的蛋白组分被称为TBP-相关因子（TAFs）。用TFIID探针寡核苷酸和HeLa细胞核抽提物，可得到一个微弱的凝胶迁移带，但很难确定为是TFIID序列特异凝胶迁移复合物。纯化的重组的TBP很难作凝胶迁移实验，这部分是由于TBP存在很强的正电荷，导致TBP/DNA复合物很难进入凝胶。纯化的TBP形成二聚体后不能结合DNA（17）。因此形成的二聚体可参与DNA结合。TFIIB不单独与DNA结合，但与TFIID结合后增强它与DNA的结合。
TFIIB与预启动复合物结合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF结合到转录启始区。故TFIIB在预启动复合物的形成中有重要作用。当用纯化的TFIID作凝胶迁移实验时，poly(dI-dC)不用加入结合反应中。结合缓冲液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。对TFIID的凝胶结合实验中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，凝胶组分是：0.5′TBE, 6%聚丙烯酰胺凝胶(19:1丙烯酰胺:双叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 电泳缓冲液组分是：0.5′TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。当研究含TFIID和TFIIB的复合物时，应从结合缓冲液，凝胶，和电泳缓冲液中去除MgCl2。这些是一般的要求，用不同的细胞抽提物和TFIID、TFIIB形成复合物作凝胶迁移实验时，应对多种因素进行优化以达到理想的条件。
8)在一次凝胶迁移实验中，用多少量的蛋白质或抽提物，和标记的DNA探针？
对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白：DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白形成特异的复合物。所加入反应的探针的量是50，000-200，000cpm32P-标记的探针（高特异活性），反应体积为1-5ul。这相当于10-50fmoles的DNA探针。探针应保存在-20oC以防止降解，在合成或标记后1-2个星期内必需使用。无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。
9)能用体外翻译法制备目的蛋白质吗？
Promega没对所有的转录调节因子作这类测试。一般，用麦胚抽提物作哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白的体外翻译，兔网织红细胞溶裂解液可能含有内源哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白。但TNT？/sup>兔网织细胞溶解液系统（a,b,c,d）与TranscendTM 生物素标记的tRNA(目录号E3201)一同使用，翻译了转录调节因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目录号E3201）产生的迁移效果和重组的AP1相同（18）。TNT？/sup>T7偶联的麦胚抽提物（b,c,d,e）在体外翻译了c-Rel。这一蛋白特异地使免疫球蛋白k轻链增强子探针产生迁移。在c-Rel结合反应中加入体外翻译的MAD-3（IkB家簇中一员）可干扰其相互作用。
10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？
它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝胶迁移反应，它们会带有目的蛋白的结合位点。
11)用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？
将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%（30：1丙烯酰胺：双叉），在特定条件下可用高或低的浓度。PH, 聚丙烯酰胺的浓度, 丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺的比会影响复合物在凝胶中的迁移。大多数蛋白用10-15伏的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压（30-35伏的电压），电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的，无沉淀。低的离子强度和丙烯酰胺基质的`箱子效果`有助于复合物的稳定。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris, pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物（Metaphor?/sup/agarose）。
12)如何在一个特定的复合物中确定一个蛋白质的存在？
部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，但有一些方法作这方面的研究。如有目的蛋白的抗体，可进行超迁移实验，抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。增量的抗体加入到结合反应中。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体结合后，再加入探针。取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度的减少。在大多数实验中，应对抗体作滴定，先使抗体：蛋白的摩尔比为1：1，然后应需要增加抗体的量。当有纯化的蛋白时，可用它们和实验的带型迁移复合物比较。除超迁移实验外，复合物中蛋白的特征也可用UV交联和标记转移来分析。在均质标记的探针和细胞核抽提物保温后，用UV照射使复合物交联，随后用DNA酶降解未保护的探针。需用均质标记的探针，因DNA酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离，干燥，放射自显影。结合蛋白的分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的蛋白的抗体对复合物作Western印迹分析（20）。如一个蛋白和DNA探针的特定序列结合，可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸，以及突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位点改变来研究复合物的形成。

使用了Promega 公司凝胶迁移实验产品的参考资料
1Xu J and Clark RAF 1997 J Cell Biol 136, 473 (SP1和NFkB保守序列寡核苷酸）
2 Dbaibo G S et al 1997 J Exp Med 185, 481（NFkB保守序列寡核苷酸）
3 Pan Z K et al 1996 J Clin Invest 98, 2042（NFkB保守序列寡核苷酸）
4 Kochekova M et al 1997 J Clin Invest 99, 3000（SP1保守序列寡核苷酸）
5 Avantaggiati M L et al 1997 Cell 89, 1175（AP1保守序列寡核苷酸）
6 Schmedite, J F et al 1997 J Biol Chem 272, 601（NFkB保守序列寡核苷酸）
7 Lee B S et al 1997 J Biol Chem 272, 174 （AP2和SP1保守序列寡核苷酸和转录调节因子）
8 Ohlsson B G et al 1997 J Clin Invest 98, 78（AP1转录调节因子）
9 In KH et al 1997 J Clin Invest 99, 1130（SP1 转录调节因子

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