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链格孢霉毒素研究进展
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链格孢霉毒素研究进展 摘要:本文综述了链格孢霉主要毒素近几年的研究进展。介绍了链格孢霉的生态学及污染情况,链格孢霉主要毒素的毒性和检测方法,以及这些毒素和人畜疾病可能的关系等。 关键词: 链格孢霉; 毒素 链格孢霉(Alternaria)是污染食物和饲料最普遍的真菌之一[1]。它广泛分布于泥土和植物里,包括谷物、蔬菜、水果以及田间作物。有多种链格孢霉是重要的植物病原体。由于它能在低温下生长,因此能引起冷藏的蔬菜、水果的腐败。链格孢霉能产生多种代谢物,其中至少有10种代谢物对动物和植物具有毒性[2]。目前从食物中检出的有链格孢酚(alternariol,AOH)、链格孢酚甲基乙醚(al-ternariolmethylether,AME)、细交链孢菌酮酸(tenuzonicacid,TeA)、链格孢霉素(al-tenuene,ALT)、细格菌毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ (alter-toxinⅠ、Ⅱ 、Ⅲ ,ATX-Ⅰ 、ATX-Ⅱ 、ATX- Ⅲ)和AAL毒素(AALtoxins)。 1 生态学及污染情况 链格孢霉对农产品侵染范围很广,随各地区的温度、湿度、通风和日照以及产毒菌株等情况的不同而不同。从美国、澳大利亚、巴基斯坦、阿根廷、印度、西班牙和英国等地的高粱、玉米、小麦、油菜籽、葵花籽、芥子、苹果和番茄中均分离到数种链格孢霉,并检出链格孢霉毒素。据美国1984年的谷物污染调查,230份(148份小麦,57份大麦,25份黑麦)样品中,114份被8种链格孢霉侵染,侵染率达77%,268株链格孢霉菌株中有101株产AOH、AME和TeA,其中76.2%的菌株至少产一种毒素,其18份培养物平均产毒量依次分别为500、400和2200mg/kg。在对油菜籽粉和葵花籽粉进行分析时发现,30份样品中有10份检出AOH、AME和TeA三种链格孢霉毒素中的一种或一种以上,平均含量依次分别为0.54、0.81和0.97mg/kg;而分别采自阿根廷、印度和欧洲地区的22份葵花籽粉里均检出上述三种毒素,平均值依次分别为0.18、0.10和1.90mg/kg。Chulze等对阿根廷的葵花籽油和粉所做的调查发现,85%的样品检出AOH,47%检出AME,65%检出TeA,平均检出量依次为0.187、0.194和0.692mg/kg。对被链格孢霉侵染的番茄、苹果、橘子和柠檬调查时发现,TeA是番茄里的主要链格孢霉毒素,19个番茄样品有11个检出TeA,最高含量高达139mg/kg,平均含量为17.6mg/kg,并检出少量AOH、AME和ALT。AOH和AME是苹果里的主要链格孢霉毒素,8个苹果有7个检出AOH,最高含量为58.8mg/kg,平均含量为7.8mg/kg;8个检出AME,最高含量为2.3mg/kg;5个检出ATX-Ⅰ ,还有少量ALT、TeA。所有橘子里均检出TeA,最高含量为61.1mg/kg,TeA、AME和AOH平均含量分别为26.6、13.1和11.5mg/kg。柠檬的情况与橘子相似。Michael等从番茄的商业生产线上采集的142份样品里有73份检出TeA,含量范围为0.4～70mg/kg。甄应中等[7]对我国河南省8个县的粮食真菌做了分离培养,链格孢霉的检出率高达82.2%,并且食管癌高发区与低发区有非常显著性差异。 2 毒性作用 链格孢霉对动植物的毒性作用早已有许多报道。第二次世界大战期间俄国曾发生发霉谷物引起的中毒事件,从人们食用的发霉谷物里分离出多种链格孢霉。用从烟草里分离出的Alternarialongipes的产毒培养物喂饲雏鸡,结果出现食欲不振、昏睡、腹泻、肌无力和昏迷,4～8d出现死亡,33%的培养物使雏鸡死亡,13%导致发育严重迟缓。病理检查表明有前胃出血,胗糜烂。Forgacs等在研究发霉饲料对家禽的影响时也发现,用链格孢霉侵染的谷物喂饲雏鸡,第3天,20只有19只出现腹泻、行动迟缓以及出血症候群引起的衰竭直至死亡,最后一只也在第4天死亡。而用棒曲霉(Aspergillusclavatu)接种的谷物喂饲的平均死亡天数为12d,黄曲霉(Aspergillusflavus)为22d,产紫青霉(Peni-cilliumpurpurogenum)为21d,对照组无死亡。Christensen等为比较链格孢霉与这三种菌属的毒性作用,用从食物和饲料里分离到的链格孢霉、曲霉、青霉和镰刀菌的培养物喂饲大鼠,78%(65/83)的链格孢霉培养物使大鼠死亡;镰刀菌的为61%(93/152);曲霉的为43%(85/197);青霉的为47%(93/196)。除了对动植物有毒性外,已有文献报道它们还具有诱变性,并可诱发大鼠前胃和食管乳头状瘤。匡开源等[3]在对陕西大骨节病病区粮食所做的调查中发现,链格孢霉是污染小麦的优势菌,并检出AOH和AME。因此,链格孢霉与曲霉、青霉和镰刀菌一样,也是一种重要的产毒菌。 链格孢霉毒素大体上可以分为4类。它们对哺乳动物、细菌细胞和小鼠有不同程度的毒性作用,总的来说TeA、ATX-Ⅰ 、ATX-Ⅱ 和ATX-Ⅲ 比AOH和AME毒性要大得多。 第一类是二苯并吡喃酮衍生物(diben-zopyronederivatives),主要有AOH、AME和ALT,是多种链格孢霉的主要代谢物。AOH和AME对实验动物的急性毒性较弱,小鼠的LD50>100mg/kg。给小鼠皮下注射AOH100mg/kg,9至12天后,胚胎吸收量和死亡数均增加。Pollock等研究了AME的亚急性毒性作用和致畸性。实验用怀孕8d的金黄仓鼠,分为4组,其中1组为对照组,另外3组分别腹腔注射50、100、200mg/kgAME,中低剂量组未观察到毒性作用,高剂量组吸收数增加,胎鼠平均体重减少,内脏严重坏死。雄性SD大鼠经口给药5周,未观察到亚急性毒性。Pero等发现1∶1的AOH和AME混合产生协同作用,单独的AOH或AME对HeLa细胞的毒性作用之和比它们的混合物的毒性作用要弱。AME可以增强AOH的胚胎毒性,反之亦然。小鼠经口给400mg/kgAME时,只有10%的死亡率,而同样剂量的AOH却有30%的死亡率。小鼠经口给100mg/kgAOH时,表现出胚胎毒性,而这个剂量的AME却无明显的胚胎毒性和致畸性。Scott等[4]的研究表明,在沙门菌试验中无代谢激活,AME仍有弱诱变性,TeA无诱变活性。但Valerie等后来用纯度更高的AOH和AME重新实验,发现AOH和AME无诱变性。Scott等的实验结果可能是有少量细格菌毒素存在所致。而在An等的研究里,AME对E.coliND-160有很强的诱变性。因此,AME可能对不同的基因位点或DNA序列有选择性的诱变。ALT对HeLa细胞有毒性作用,给3只小鼠皮下注射50mg/kg,有1只死亡。 第二类是四氨基酸衍生物(tetramicacid),即TeA。开始研究这种化合物不是因为它污染食物,而是因为可以用它来治疗癌症。分别经静脉和经口单次给TeA钠盐50～398mg/kg,小鼠和大鼠出现心动过速、呕吐、生命必需器官出血,尤其是胃肠道大量出血,心血管衰竭直至死亡。TeA钠盐经口给药,雌、雄小鼠经口给药的LD50值分别为81和186mg/kg;雌、雄大鼠经口给药的LD50值分别为168和180mg/kg。此外,TeA钠盐、镁盐还与一种发生在非洲的人类血液紊乱疾病——奥尼赖病(血小板减少性紫癜)有关。用加入145～370mg/kgTeA的饲料喂饲大鼠,几天后出现胃肠道出血,9～10d开始出现死亡。用含29mg/kgTeA的饲料喂饲大鼠3周后,出现过度兴奋、体重少量减轻,但无器质性病变。Meronuck等在离体实验中发现TeA的产量与培养组织的中毒状况有正相关关系。尽管TeA无诱变性,但它能抑制氨基酸的结合,阻止蛋白质和DNA合成,干扰核糖体释放新的蛋白质。Gregory等为研究链格孢霉代谢物的毒性,用7日龄鸡胚试验,将AOH、AME、ALT和TeA经卵黄囊注射,AOH、AME和ALT剂量分别为1000、5000和1000μg时无死亡和畸形发生。而TeA为548μg时有一半死亡,但在致死量和半致死量时,均未有致畸效应。Sauer等的试验结果表明,只产AOH、AME和ALT的培养物对雏鸡和大鼠无毒性作用,而加入一定量的TeA和ATX- 后,对其却是致命的。单独的TeA要产生这样的急性毒性,所需剂量远远超过这个加入量。这表明TeA能与其它真菌毒素协同作用,产生急性毒性。TeA被认为是最重要的链格孢霉毒素。 第三类是衍生物(perylenederivatives),有ATX-Ⅰ 、ATX-Ⅱ 、ATX-Ⅲ ,是小量的链格孢霉代谢物。ATX-Ⅰ 的急性毒性低,小鼠经口给药LD50为100mg/kg,静脉注射200mg/kg死亡。ATX-Ⅰ 和ATX-Ⅱ 对HeLa细胞有毒性作用。即使无代谢激活,ATX-Ⅰ 、ATX-Ⅱ 和ATX-Ⅲ 均表现诱变性,其中ATX-Ⅲ 对沙门菌TA98的诱变性最强,其次是ATX-Ⅱ 和ATX-Ⅰ。 第四类是一系列长链氨基多元醇的丙三羧酸酯类化合物(tricarballylicesters),即AAL毒素,包括TA、TB、TC、TD和TE,是真菌病原体Alternariaalternata(AAL)f.sp.lycopersici的代谢物,是寄主专一性的毒性。它们的结构及毒性与伏马菌素(fumon-isins)相似。TA能抑制大鼠的肝细胞和狗的肾细胞的繁殖,对培养的哺乳动物细胞有毒性作用,抑制神经鞘氨醇的合成。此外,1992年有人报道Alternariaalternata能产伏马菌素B1(FB1)。1996年Abbas等用连续流动液相色谱/快速原子轰击/质谱法(CF/FAB/MS)证实,Alternariaalternata的孢子和菌里确有FB1存在。 3 产毒培养 链格孢霉所产毒素很多,因此产毒的条件变化也很大。但各种毒素共有的产毒有利条件是温度在20℃,相对潮湿的环境。避光对产AOH和AME有利,蓝光和白光在生长初期抑制AOH和AME的产生。Mass等比较了多种链格孢霉在液体和固体培养基上产AOH和AME的情况。所有5种不同链格孢霉的14株分离菌株均产AOH和AME,但是产毒量随菌株的不同和培养基的不同变化很大。在所试验的3种液体培养基药物介质肉汤(PH)、酵母膏蔗糖肉汤(YES)改良察氏培养基(MCD)中,AOH和AME的产量在MCD上最高。在这些菌株中,产毒量最高的是一株A.tenuis,在300g稻米培养基上25℃避光培养14天,AOH和AME的产量分别高达16mg和125mg。Cheng等还比较了AlternariaalternataRL671-2在合成、半合成和稻米培养基上生长及产AOH、AME和ALT的情况。三种毒素在半合成培养基上的产量比在合成培养基上的高,改变合成培养基里C/N比值将大大增加毒素产量和菌丝重量。合成培养基因为介质简单,容易纯化等优点,适合放射标记毒素的生产,以便于进一步研究毒素在动物体内的代谢。小麦、黑麦和全小麦面包是产AOH、AME和ALT较好的培养基。Davis等将从棉花种子和棉铃上分离到的Alternaria菌株在2%酵母浸膏-4%蔗糖培养基上25℃静止培养28d,同时在相对湿度为99%～100%的棉花种子培养基上25℃静止培养28d。除A.alternata938以外,其它5株的培养物均产TeA,在棉花种子培养基上产量最高(A.tenuissima,266mg/kg)。Stinson等发现,几乎所有Alternaria菌株在番茄上的TeA产量均远远高于在苹果上的,这两种培养基都是低氮培养基,也许是别的因素导致TeA产量的差异。将野生型和实验室培养的Alternaria菌株接种于番茄和苹果均能产ATX-Ⅰ 和ATX-Ⅱ。Abbas等将A.al-ternata(SWSL#1)NRRL18822接种于高压灭菌过的稻米培养基上,每天暴光12h,12h避光,28℃培养4周,可产AAL毒素50～75mg/kg。 4 检测方法 检测链格孢霉毒素的方法有很多,如薄层色谱法(TLC)、气-液色谱法(GLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)。1984年以前主要是用TLC法,现在多数已被HPLC法取代。John等总结了TLC法检测二苯并吡喃酮衍生物和衍生物的情况。在TLC硅胶板上,紫外荧光波长下的最小检出量为0.1μg。用薄层色谱扫描方法可定量分析AOH和AME,这两种化合物的最大发射波长在460nm左右,含量与荧光峰峰高在0.1～1.0μg之间有线性关系,回收率大于90%。检测这类化合物主要是用HPLC法,正相和反相均有报道。目前,较多的是采用反相HPLC法,配合不同的检测手段。使用紫外检测器的报道较多,在256nm波长时,AOH和AME的最小检出量分别为1.6和0.7μg/L。用荧光检测器,激发波长为278nm时,AOH和AME的线性范围为0.05～5ng,AOH的检出限为3ng/g;用电化学检测器,可检测10～50pg水平AOH、AME、ATX- 和ATX- ;用二极管阵列检测器,AOH、AME、ALT和ATX- 的检测限分别为3、10、5和10ng,回收率在50%～76%范围内。Visconti等用双串联电极电化学检测法检测玉米、大米和番茄中的ATX-Ⅰ 和ATX-Ⅱ ,线性范围分别为0.24～500ng和0.42～530ng,检出限分别为30pg和100pg,变异系数线分别为5.1%和3.4%。Chu等报道的反相HPLC法(梯度洗脱)可分析检测制备柱和半制备柱分离流出的AOH、AME和ALT。罗毅等建立的液-质联用法(HPLC-MS),可同时检测粮食中的AOH和AME,最低检出限均为1ng,回收率均大于79%。 TLC法检测TeA与用该法检测二苯并吡喃酮类化合物相类似[28]。GC法是将TeA或TeA盐转化为三甲基甲硅烷衍生物,用火焰离子化检测器检测,线性范围为1～20μg,最低检出限为0.1μg,回收率为75%。Michael等[6]建立的反相HPLC法,荧光检测器检测番茄酱里的TeA,检出限为25ng/g,回收率为83%;而用紫外检测器,波长280nm,检出限为2～5ng,回收率为67%～94%;用二极管阵列检测器,检出限为0.4ng,线性范围1～80ng,回收率为88%;Heisler[38]建立的反相HPLC法,以丙酮/水(65∶35)为流动相,检测波长为324nm时,可分离检测AOH、AME和ALT。用同一根柱,以甲醇/水(90∶10)为流动相,检测波长为278nm时,可分离检测TeA。Scott将AOH、AME、ALT、ATX-Ⅰ 和TeA转化为七氟丁酸的衍生物后,用毛细管气-质(GC-MS)联用法可分离、检测并确证这些毒素。 由于AAL毒素结构与伏马菌素相似,因此检测方法也类似。有TLC、MS和HPLC等方法。目前,主要是用反相HPLC法。Yu等报道的液相色谱-酶联免疫法(LC-ELISA)检测A.alternata培养物里的TA,检出限小于2ng。 5 生物合成[5，1] AOH和AME以及其它二苯并吡喃酮衍生物属于聚酮化合物(polyketide)。聚酮化合物通常是真菌毒素的前体,与真菌脂肪酸的形成机制相似。目前大家所接受的这类化合物的形成途径是一个乙酰辅酶A和六个丙二酰辅酶A通过头尾醛醇缩合反应(这个缩合过程没有氧原子及其它原子的丢失),首先形成芳香环(即形成AOH)。AOH是大多数二苯并吡喃酮衍生物的形成前体。S-腺苷甲氨硫酸与AOH反应生成AME。AME在一定条件下发生蒽醌重排,降解产物就是其它二苯并吡喃酮衍生物。TeA形成是一单位的氨基酸(L-异亮氨酸、L-色基酸或L-缬基酸)和二单位的乙酸缩合形成四氨基酸环,但其形成机制还未完全探明。 6 结语 链格孢霉分布广泛,其有毒代谢产物污染农作物的情况相当普遍[1],但是由于人们平均每日的摄入量很低,未能引起足够重视。虽然食用含小量毒素的食品不会引起急性中毒,但是长期食用有可能引起慢性中毒。目前从食物里能同时检出两种甚至两种以上的链格孢霉毒素。越来越多的证据表明这些毒素有协同作用,有必要进一步研究这些毒素的协同作用以及在食物及饲料里的发生率及稳定性。 参考文献 [1]杨 欣等.国外医学卫生学分册，2000，27（3）：182-186. [2]Chen BingQing,LiuZhi-Chen.Modern Food Hygiene.2001,231-235 [3]匡开源等.中国地方病防治杂志,1995,10(5):284-285. [4]Pollock GAetal. FoodChem Toxicol,1982,20:899-902. [5]Stinson EE.J. Food Protection,1995,48(1):80-91. |
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