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2型糖尿病相关基因定位研究
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2型糖尿病的发病机制至今仍不甚明了，但流行病学研究显示其重要的遗传背景，且其遗传方式符合多基因病遗传模式，即有多个基因参与了2型糖尿病的发生和发展，正因为其遗传方式不符合经典的孟德尔遗传规律，因而给2型糖尿病相关基因的研究带来了很大的困难。随着人类基因组计划实施和现代遗传学技术发展，一大批DNA遗传标志在染色体上得到精确定位以及快速高效的连锁分析软件的出现，使人们有可能通过一种全新的策略―基于基因组扫描的定位克隆方法来研究2型糖尿病的相关基因。 至今为止，仍无中国人及亚洲人群2型糖尿病基因组扫描的报道，本文首次在国际上报道了中国汉族人2型糖尿病易感基因位点。 通过收集大量2型糖尿病患病同胞对家系，利用人类多态性研究中心公布的微卫星位点，对这些家系进行全基因组扫描和连锁分析，以期找出2型糖尿病相关基因所在的染色体区域。找出D9S175位点附近候选基因在中国人群中的单核苷酸多态性，并探讨其与2型糖尿病的关系。 对102个华东地区汉族人2型糖尿病家系，其中包括糖尿病患者282人，74个家系有2个糖尿病同胞，18个家系有3个糖尿病同胞，10个家系有4个糖尿病同胞，利用Perkin-Elmer生物技术部提供的荧光标记的微卫星位点引物成套试剂盒，共247微卫星位点，进行全基因组扫描，并分别利用非参数分析及参数分析软件GENEHUNTER和MLINK进行连锁分析，找出染色体上与2型糖尿病连锁的位点及区域。对D9S175位点附近的部分候选基因的5’上游的调控序列、外显子以及与外显子紧邻的内含子区域的序列用双向测序法进行SNP检测，SNP筛查主要通过PolyPhred软件进行，并通过2型糖尿病患者的样品池与正常对照人群DNA样品池的SNP位点的峰高比初步估计该位点等位基因在两组人群中的分布频率。 全基因组扫描结果显示9号染色体上D9S171和D9S175同2型糖尿病有连锁倾向，其非参数分析统计量Zall-score 分别为3.28624和2.93932，其相应的P值分别为1.19×10－4和4.73×10－4，参数分析结果也显示类似的结果，其Lod-score分别为4.612133和4.288642，P值分别为2.44′10－5 和5.14′10－5。此外，对2型糖尿病按体重指数进行分组后发现，低体重指数组在20号染色体上D20S196位点同2型糖尿病有较强连锁倾向，其NPL-score从1.52上升至2.92，而P值则从0.04下降到6.53×10－4。另外基因组中尚有多个位点及染色体区域显示同2型糖尿病呈较弱的连锁倾向。 其中9号染色体上的D9S171和D9S175两个位点及其附近的区域可能存在2型糖尿病易感基因，根据GENETHON公布的人类遗传学图谱，这两个位点分别距9号染色体短臂末端42cM及62.8cM。最近，在其它人群中，也发现这两个位点附近的区域同2型糖尿病或其相关指标连锁。这些结果提示9号染色体上可能存在着不同种族及人群共有的2型糖尿病易感基因。从候选基因角度看，9q13-21区域中也存在着一些重要的候选基因，如X25基因，该基因编码一名为frataxin的线粒体蛋白，这种蛋白表达量减少可引起一种少见的遗传性疾病――Freidriech共济失调，这种疾病的患者常伴有糖代谢紊乱，研究发现X25基因的第一个内含子GAA重复序列的纯合扩增可引起这种疾病，正常人X25基因的第一个内含子GAA重复序列可有9次以下的重复，而Freidriech共济失调患者重复次数可达到100至200次甚至更多。该重复序列中等程度的扩增(10～40次)可引起糖代谢紊乱而又不至于引起共济失调，因而同2型糖尿病呈显著相关。但X25基因是否是中国汉族人2型糖尿病易感基因，还有待于进一步验证。 另一个值得一提的发现是2号染色体长臂近末端处D2S126显示同2型糖尿病连锁可能(P值为0.008)。事实上，在D2S126附近还有两个重要的候选基因，一个是NEUROD1，该基因编码的蛋白同HLH蛋白E47形成异二聚体后，可同胰岛素基因启动子上的E-box序列结合，从而调控胰岛素的分泌，Malecki等人发现，该基因的杂合突变同2型糖尿病相关；另一个重要的候选基因为胰岛素受体底物1基因，该基因编码的蛋白质在胰岛素信号转导过程中起重要作用，研究发现，该基因的某些特殊等位基因同2型糖尿病相关，因此，2号染色体长臂近末端处可能是引起2型糖尿病易感性的一个重要区域。 由于2型糖尿病是一种异质性较强的复杂性状疾病，同样是迟发型2型糖尿病患者，其易感基因在不同家系中可能有所不同，因而将由不同易感基因引起的糖尿病的家系合在一起进行连锁分析，有时反而会降低阳性位点的Lod-score，造成假阴性结果，而通过临床表型对家系进行一些初步的分类，可降低家系的异质性程度，从而降低假阴性结果。研究结果提示，在多基因疾病易感基因研究中，按某些中间性状对研究对象进行分组后，可提高基因组扫描对阳性位点检测的灵敏度。因而我们在完成了102个家系的全基因组扫描后，又对这些家系按发病年龄及体重指数进行分组，并对各组重新进行连锁分析。我们之所以选择发病年龄及体重指数进行分组，而未选择如胰岛素分泌水平及胰岛素抵抗程度等理论上更加直接的中间性状，是因为这些指标受其它因素影响较多，如血糖水平、疾病持续时间以及用药情况等都会影响胰岛素分泌及胰岛素作用，而发病年龄及体重指数则受其它因素影响较小，因而更客观而准确。结果，按发病年龄分组后，并未发现新的阳性位点，但按体重指数分组后则发现低体重指数组中，D20S196位点的NPL-score由原来的1.5上升到2.9，p值由原来的0.04下降到6×10－4，强烈提示该位点同2型糖尿病连锁，在本次研究中，我们是以体重指数23kg/m2来进行分组而非通常的25 kg/m2这个区分肥胖与非肥胖人群的标准。我们的研究结果表明在该位点所在的区域可能有某个与低体重指数相关的基因(可能是引起胰岛素分泌不足的基因)引起了2型糖尿病易感性的增加，事实上，D20S196所在的区域(20q13.3)也是目前国际上报道较多的同2型糖尿病连锁的区域之一，已有至少4个小组报道了该区域同2型糖尿病连锁，尽管其具体位置略有不同；另外，从候选基因角度来看，20号染色体上也存在着多个重要的糖尿病候选基因，如距短臂末端约65cM的HNF－4α(MODY1)，它是核受体超家族成员之一，是一种转录因子，在将细胞外信号传递到细胞内引起基因转录改变的过程中起重要作用，此外，距短臂末端87－100cM的PCK基因也是一个重要的候选基因，它是糖异生过程中的限速酶之一。20号染色体长臂上尚有另外几个重要的候选基因：agouti signaling protein、HNF-3β(它们分别距短臂末端53.5-58.9cM及～50cM)以及磷脂酶C－G1和CCAAT增强子结合蛋白B (这两个基因均位于距短臂末端约70cM的区域中)。鼠的agouti基因突变可引起肥胖相关的2型糖尿病，其机制可能为骨骼肌中钙离子通道的改变；HNF-3β可调节HNF-4α和HNF-1α基因的表达；PLCG1基因编码一在细胞内信号转导过程中起作用的第二信使蛋白；C/EBP-β基因则编码一转录因子，这个转录因子在肝细胞中cAMP诱导的PCK1基因的表达过程中起着重要的作用。 在D9S175位点附近共选取4个基因进行检测，它们分别为RORB、FLJ20808、FLJ20087、FRDA，共发现9个SNP，其中2个位于5’调控区域、1个位于3’非翻译区、2个位于外显子区域、4个位于与外显子较近的内含子区域，这些SNP中8个SNP在患者样品池和正常对照样品池中频率分布无明显差异，仅RORBI9-59在患者样品池和正常对照样品池中频率分布有明显差异(达到60%以上)，该SNP位于RORB基因第9个内含子中。 本次实验在4个候选基因中共检测了约12kb长度的DNA片断，结果找到9个SNP，其中2个位于3’上游的调控序列，1个位于3’非翻译区，2个位于外显子，4个位于紧邻外显子两侧的内含子区域，平均1.3kb出现1个SNP，略低于基因组中SNP出现的平均频率(约500～1000bp出现1个)，这主要是因为我们所选的检测区域多为受选择压力较大的外显子及与其紧邻的内含子区域。这些SNP中8个SNP的等位基因频率在疾病样品池和对照组样品池无明显差异，只有一个SNP(RORBI9-59)其等位基因频率在疾病样品池和对照组样品池中差异超过15%，达到60%以上，提示该SNP可能和2型糖尿病相关，该SNP位于RORB基因第9个内含子中，距第9个外显子59bp。RORB基因全称为RAR-related orphan receptor B，是一种转录因子，为细胞核受体家族成员之一，RAR受体可与多种核受体形成二聚体并起到信号转导作用，它也能和RXR竞争结合PPARG，从而抑制后者的信号转导，但RORB的功能尚不清除，小鼠中转基因及基因剔除试验也未发现该基因同糖代谢有关。由于目前我们尚未对该SNP进行大样本量的基因分型和相关分析，因此尚难断定它是否同2型糖尿病相关。 关键词：2型糖尿病 易感基因 基因组扫描 单核苷酸多态性 The Positional Study Of Type 2 Diabetes Related Genes Abstract Part I Genome-Wide Search for Type 2 Diabetes Susceptibility Genes in Chinese Hans Aims: To search the type 2 diabetes susceptibility genes in Chinese population. Methods: A genome-wide scan was performed using both parametric and non-parametric linkage analyses. 102 families (478 family members) from Chinese Hans residing in the East and South-East China, including 282 diabetic patients, among them 74 families with 2 affected siblings, 18 families with 3 affected siblings and 10 families with 4 siblings. 247 fluorescence labeled microsatellite markers, with an average resolution of 15cM, were amplified. Genehunter and Mlink of Linkage package were used for the non-parametric and parametric linkage analyses. Results: Two loci on chromosome 9 D9S171 and D9S175 showed suggestive evidence for linkage, with Zall-score of 3.29 and 2.94 respectively, and p-value of 1.19′10-4 and 4.73′10-4. The corresponding Lod-score of these two loci were 4.61 and 4.29 respectively with the p-value of 2.44′10-5 and 5.14′10-5, under additive model. A locus on the long arm of chromosome 20 D20S196 showed a rise of Zall-score (from 1.52 to 2.92) and a corresponding decrease of p-value from 0.04 to 6.53′10-4 when families with lower BMI were analyzed alone. Other loci with weaker evidence for linkage were also observed. Conclusions: Our results suggest that chromosome 9 may contain genes involved in the susceptibility to type 2 diabetes in East and Southeast Chinese Han population, while chromosome 20 may hide genes that were linked to type 2 diabetes in families with lower BMI. Other regions may also hide susceptibility genes with minor effect, but further investigation is required to confirm the results. Part II Study on the single nucleotide polymorphism(SNP) of candidate genes near D9S175 Aims: To find out SNPs of candidate genes near D9S175 in Chinese population and study their relationship with type 2 diabetes. Methods: Bidirectional sequencing was used to detect SNPs in the 5’regulatory regions, exons and partial introns close to exons of some candidate genes near D9S175. PolyPhred was used to detect SNPs in individual samples. A preliminary estimation of the distribution of alleles in diabetic population and normal control population was performed using the comparison of the ratio of pic-height of DNA pool of diabetic patients and that of normal controls. Results: Four genes near D9S175 were screened for SNPs, they were RORB, FLJ20808, FLJ20087 and FRDA. 9 SNPs were discovered, among them 2 in 5’ regulatory region, 1 in 5’ UTR, 2 in exons and 4 in introns close to exons. The distribution of alleles was significantly different between the DNA pool of diabetic patients and that of normal control subjects only in RORBI9-59, the SNP in the 9th intron of RORB gene. Conclusion: SNP related to type 2 diabetes may exist in RORB gene, but the conclusion need to be confirmed with genotyping and association study in large samples. Key Words: type 2 diabetes, susceptibility gene, genome-wide scan, single nucleotide polymorphism |
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