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Northern杂交试验指导手册（转贴）
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Northern杂交试验指导手册 DIG标记的Northern杂交试验指导 一、 RNA提取 方法一、改良异硫氰酸胍提取法 试剂及其配制 异硫氰酸胍变性液： 贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用（不超过3个月）。 工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为： 4mol/L异硫氰酸胍 25mol/L柠檬酸钠pH 7.0 0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl) 0.1mol/L巯基乙醇(2-ME) 其它溶液： 2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0) 水饱和酚（pH 3.5） 49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇 100%异丙醇 70%乙醇（用DEPC处理水配制） DEPC处理后高压灭菌水 试验程序 1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。 2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。 3．顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。 4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。 5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。 6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。 注意事项 RNA提取过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方面的问题需要特别控制，一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。 方法二、改良Krapp提取法 试剂及其配制 RNA抽提掖： 母液：4mol 异硫氰酸胍 20mmol EDTA 20mmol MES pH 7.0 工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。 RNA重悬液：2mol LiCl 10mmol NaAc 调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。 试验程序 1． 取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。 2．4℃条件下8000rpm离心10min.，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min.。 3．上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。 4．小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。 5．在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。 6．4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。 二、RNA质量检测 提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。 方法一、紫外吸收检测 试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。 dH2O 试验程序 1．预热紫外分光光度计10～20min.。 2．取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。 3．取4μl RNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。 4．将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。 RNA浓度和纯度分析 浓度计算：对于单链RNA，OD260＝1.0时，RNA浓度为40μg/ml，按照上述稀释方式，即OD260＝0.1时，其RNA浓度为1μg/ml。 纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。 方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测 试剂及其配制 MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 ) 50mmol/L NaAc 10mmol/L EDTA 准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。 上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝 其它试剂：甲醛（37%溶液，13.3mol/L） 甲酰胺（去离子） 将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1 小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70℃贮存。 溴化乙锭（EB，10mg/ml） 70%乙醇 试验程序 1．将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。 2．配制琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。 3．待胶凉至60~70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。 4．样品制备：取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺（去离子）10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀；将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3μl上样染料，混匀。 5．上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。 6．电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。 RNA样品质量分析： 完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。 植物总RNA中28S rRNA及18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。 三、为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆 A． 载体选择 为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。 常用的这类载体有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ). pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ). PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ). Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ). 按照试验的经济有效原则，本试验选用 Bluescript M13-。 B. 目的DNA序列与载体连接 从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断；采用标准质粒提取方法提取载体质粒（见黄健试验）。然后按下列程序进行连接。 试剂及其制备 T4 DNA连接酶 连接缓冲液（可直接购买或配制），10X 缓冲液配方为： 0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8 0.1 mol/L MgCl2 50mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。 BSA 0.25mg/L PEG (3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。 无菌蒸馏水（SDW） 试验程序 1． 建立以下反应体系（终体积20μl）： 4μl 质粒 ( 50μg/μl) 6μl 目的DNA ( 100μg/μl) 2μl 10X 连接缓冲液 2μl DNA 连接酶 6μl 无菌蒸馏水 2． 反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。 3．取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。 注意事项 1．保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。 2．DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。 3．为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。 C．感受态细胞制备（CaCl2法） 试剂及其配制 LB培养基（200ml）：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。 CaCl2 0.1mol/L，4℃保存。 E. coli菌株：JM105或TG1。 试验程序 1．将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。 2．取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD600＝0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。 3．将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。 4．将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。 5．沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。 D. 质粒DNA转化 试剂及其配制 LB培养基（同C）。 氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。 含氨苄青霉素（AP）的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。 IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。 X – Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。 试验程序 1．取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10μl，轻轻混匀后置于冰上30min.。 2．然后置于42℃水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。 3．向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基，37℃下振荡培养1小时。 4．与此同时，将LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。 5．将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超净工作台中放置片刻）置于37℃下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。 E. 转化质粒的快速检测 试剂及其配制 煮沸缓冲液：蔗糖 8％ Triton X-100 1.5% EDTA(pH 8.0) 50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L LB培养基（同C） 氨苄青霉素（AP）（同D） 试验程序 1．选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。 2．将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。一份于4℃下保存备用，每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。 3．将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中，加入25μl溶菌酶后，涡旋混合。 4．将管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。 5．取10μl上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。 6．在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。 如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2ml TB培养基（每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠）中，37℃下振荡培养过夜，取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150μl 50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70℃条件下保存。 四、模板DNA的制备 A．质粒DNA的小量提取 试剂及其配制 含AP的LB液体培养基 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 1mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10mmol/L EDTA 50mmol/L 葡萄糖 高压灭菌15min.后，4℃贮存。 溶液II: 0.2mol/L NaOH 1% SDS（临用前现配制） 溶液III（100ml）：5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml dH2O 28.5ml 4℃贮存。 酚∶氯仿（1∶1） 95%和70%乙醇 试验程序 1．在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中，37℃下振荡培养过夜。 2．取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。 3．将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次（切勿振荡），再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。 4．在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。 5．加入等量酚∶氯仿（1∶1），振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。 6．加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。 7．用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE重新溶解质粒DNA，取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。 B． 质粒DNA的线性化 试剂及其配制 Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液 酚∶氯仿（1∶1） 3mol/L NaAc(pH 5.2) 100%和70% 乙醇 DEPC-H2O 试验程序 1．在离心管中依次加入：质粒DNA 10μl (1μg/μl) 10×内切酶缓冲液 10μl dH2O 80μl Sal I或Not I 2μl(10U/μl) 2．37℃保温反应2小时以上。 3．消化液用100μl的酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min. 4．将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。 5．4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。 6．线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。 此帖被评分,最近评分记录财富:10 (by wangsg) 回帖是一种美德！ 欢迎大家来生命科学版和材料科学版！！！ [楼 主] | Posted: 2005-11-10 12:27 hwzgj 级别: 初级版主 精华: 1 发帖: 1585 威望: 303 点 财富: 23 果果 认证指数: 63 管理指数: 96 点 在线时间:723(小时) 注册时间:2005-05-07 最后登录:2006-03-24 五、RNA探针制备（根据the DIG system user's guide） A． 地高辛标记的体外转录 试剂及其配制（试剂盒提供）： 10× NTP标记混合物：in Tris-HCl (pH 7.5) 10mmol ATP 10mmol CTP 10mmol GTP 6.5mmol UTP 3.5mmol DIG-UTP 10× 转录缓冲液：400mmol Tris-HCl(pH 8.0) 60mmol MgCl2 100mmol DTE(dithioerythritol) 20mmol亚精胺 100mmol NaCl 1unit/mlRNase抑制剂。 10unit/μl DNase I (RNase-free) 20unit/μl Rnase抑制剂 20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶 4mol/L LiCl 200mmol/L EDTA DMPC-H2O |
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试验程序（带手套操作） 1．在一经DMPC处理并高压灭菌的无Rnase污染的微型离心管中依次加入下列反应物（离心管置于冰上）：线性化模板DNA 4μl(1μg) 10×NTP标记混合物 2μl 10×转录缓冲液 2μl DMPC－H2O 10μl T3或T7 RNA聚合酶 2μl 2．轻轻混匀反应物，37℃保温反应至少2小时。 3．如果必要，向反应体系中加入2μl无Rnase污染的DnaseI，37℃下再保温反应15min.以除去残留的DNA模板（由于DIG标记的RNA转录量大大超过DNA模板量，因此，这一步有时也可以省略）。 4．向反应体系中加入2μl 200mmol/L的EDTA终止转录反应。 5．再向反应体系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇，4℃下沉淀过夜 6．4℃下，12000rpm离心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗涤一次，真空干燥。 7．沉淀按1μg/10μl的浓度重悬于DEPC-H2O中（每一反应体系约10μg），并向其中加入20unit Rnase抑制剂，置于-20℃保存备测，检测后按一次杂交使用的体积分装再置于-70℃下保存。 DIG标记的RNA在-70℃条件下可以稳定地保存至少1年。 B. DIG标记有效性检测 RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。 方法一、用标准DIG测试条比较鉴定 使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。 试剂及其配制 20×SSC：3mol/ NaCl(175g/L) 0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O(88g/L) pH 7.0 RNA稀释缓冲液：DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:3:2) Anti-DIG-AP NBT溶液：75mg/ml NBT溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中 BCIP溶液：50mg/ml BCIP溶解在DMF中 DIG空白试剂条：带正电荷的尼龙膜 对照试剂条：在相同膜上已用不同浓度的DIG标记DNA点样（300,100,30,10,3pg） 洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid 150mmol NaCl 0.3%(v/v) Tween20 pH 7.5 Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid 150mmol NaCl pH 7.5 封闭液：5% (w/v) SDS 17mmol/L Na2HPO4 8mmol/L NaH2PO4 室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。 检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5) 100mmol NaCl TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0) 1mmol EDTA 试验程序（带手套操作） 1．将转录反应物稀释成浓度约为1μg/ml，即取前述转录标记物1μl加入99μlRNA稀释缓冲液，如果转录标记反应正常其浓度应大约为1μg/ml。 2．取5支Eppendorf管，按A、B、C、D、E顺序编号，将1μg/ml浓度的RNA标记物按下列方式稀释成一系列浓度： 编号 RNA标记物稀释方法 RNA终浓度 A 1μg/mlRNA 10μl＋RNA稀释缓冲液23μl 300pg/μl B 1μg/mlRNA 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl C A 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 30 pg/μl D B 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl E C5μl + RNA稀释缓冲液45μl 3 pg/μl 3．将空白测试条置于一聚酯膜上，以每一浓度1μl的量在测试条上点样，在聚酯膜上做好点样浓度标记，切勿直接在测试条上做任何记号，切勿用手接触测试条。 4．室温干燥约2min.，同时制备测试溶液。 5．在2ml封闭液中加入1μl Anti-DIG-AP。 6．显色底物溶液：在2ml检测缓冲液中加入9μl NBT溶液和7μl BCIP溶液。 7．准备5个样品池（2.5 ~ 5ml容量），1～6顺序编号，依次加入2ml以下溶液。 ①. 封闭液； ②. 抗体溶液（第5项）； ③. ③④⑤洗膜缓冲液； ④. 检测缓冲液； ⑤. 显色底物溶液（第6项） 8．将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理，两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。 ①. 封闭， 2min.→ ②. 抗体结合， 3min.→ ①. 封闭， 1min.→ ③． 洗膜, 1min. → ④． 平衡， 1min. → ⑤. 显色反应（黑暗），5－30min. 9．显色反应30min.即停止反应（延长显色反应时间，会增加背景而影响结果比较），用水漂洗测试条，将其置于3mm Whatman滤纸上空气干燥，然后在光下检测。 结果评估 显色反应进行5～10min.时，对照测试条中300pg浓度的样点即会出现颜色，30min.时3pg的样点也可见颜色，随即停止颜色反应。漂洗后比较对照与待测样品颜色，根据对照浓度与待测样品的稀释浓度计算标记物的数量。 如果标记物浓度低于10－30pg则不适宜采用这一快速检测方法。 方法二、用DIG标记的RNA对照比较检测 试剂：DIG标记的对照RNA（浓度约为100μg/ml） 其它试剂同方法一 试验程序 1．将DIG标记的对照RNA先稀释成20ng/μl（5μl对照RNA加入20μl DEPC-H2O），取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号，将对照按下列比例稀释成一系列浓度： 编号 对照RNA稀释方法 终浓度 A 20ng/μl RNA 2μl＋RNA稀释缓冲液38μl 1ng/μl B A 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl C B 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl D C 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 1pg/μl E D 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.1pg/μl F E 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.01 pg/μl * 稀释后的A－E可以在-70℃下至少贮存一年。 2．按照同样的方法将待测的DIG－RNA也稀释成一系列浓度，编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。 3．取一片尼龙膜，按照前述方法一的方法点样，第一排点对照，第二排点待测样，不必从浓度A开始，只需点C－F浓度进行检测。 4．用UV交联方法或尼龙膜也可采用120℃烘膜30min.的方法使RNA固定于膜上，再用洗膜缓冲液洗膜几秒种。 5．将膜置于封闭液中，室温下封闭30min.。 6．准备抗体溶液：用封闭液按1∶5000的比例稀释Anti-DIG-AP。 7．将膜置于抗体溶液中，室温下保持30min.，注意抗体溶液必须没过膜。 8．室温下用洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.。 9．再将膜置于检测缓冲液中2min.。 10．在10ml检测缓冲液中加入45μl NBT和35μl BCIP配制成显色底物溶液（现配现用）。 11．除去检测缓冲液，加入显色底物溶液，在黑暗下显色大约16小时（一般几分钟即可见开始显色），注意在显色过程中，切勿振荡样品盘。 12．当颜色沉淀充分后，停止显色反应，用TE缓冲液或无菌水洗膜5min.。 13．比较对照和样品的颜色测算浓度。 六、Northern 印迹杂交 A． 探针准备 DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。 在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。 B. 印迹条件 对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。 C. 试剂及其配制 MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 ) 50mmol/L NaAc 10mmol/L EDTA 上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝 甲醛（37%溶液，13.3mol/L） 染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝 甲酰胺（去离子） 70%乙醇 SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L) 0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L) 用1mol/L HCl调整至pH 7.0 Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V) 用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml 于-20℃保存。 预杂交溶液：5× SSC 5× Denhardt 溶液 50%(w/v) 甲酰胺 1%(w/v) SDS 100μg/ml 鲑鱼精DNA（用前加热变性后加入） 杂交溶液：DIG-RNA探针用预杂交液稀释成适当浓度 2×洗膜缓冲液：2×SSC 加入0.1% SDS 0.5×洗膜缓冲液：0.5× SSC加入0.1% SDS 0.1×洗膜缓冲液：0.1× SSC加入0.1% SDS D. Northern转膜 转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳参照RNA分离中的电泳方法，根据需要选用适当的 分子量Marker. 1．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。 2．构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。 3．用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。 4．剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。 5．取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。 在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。 6．拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。 7．取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。 8．交联：方法1. 将膜夹于两张滤纸之间，在80℃真空烘烤0.5～2小时；方法2. 将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。 对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5 J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。 9．转膜效果检测：如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡5～10min.。可见明显的5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。 E．杂交 建议杂交条件：探针浓度50~100ng/ml，温度68℃过夜。 1．将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每100cm2膜20ml预杂交液），封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。 2．将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性，立即使用)，用预杂交液稀释成设定浓度。 3．将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的杂交液，在设定杂交温度条件下（68℃）杂交过夜。 4．杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中，贮存于-70℃以备重复使用。重复使用时，解冻并在68℃下变性10min.。 5．洗膜：杂交膜取出后用2×洗膜缓冲液室温下洗膜2次，每次15min.，除去非结合探针以减少背景。接下来用0.5×洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.，洗膜温度42℃，然后再在0.1×洗膜缓冲液中洗膜2次，每次15min.，洗膜温度68℃。当探针长度小于100bp时，最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。 七．杂交结果检测 方法一、化学发光检测 试剂及其配制： 洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid 150mmol NaCl 0.3%(v/v) Tween20 pH 7.5 Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid 150mmol NaCl pH 7.5 封闭液：5% (w/v) SDS 17mmol/L Na2HPO4 8mmol/L NaH2PO4 室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。 检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5) 100mmol NaCl TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0) 1mmol EDTA Anti-DIG-AP CSPD: 25mmol CSPD（用前稀释） 检测程序： 1．杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。 2．将化学发光底物置于室温下。 3．用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.（封闭过程在摇床上轻轻摇动），在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。 4．在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶10000)，3μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。 5．在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。 6．去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.。 7．去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。注意：在使用化学发光底物处理之前，膜必须保持湿润，哪怕是轻微的干燥也会产生很高的背景。 8．用检测缓冲液稀释CSPD（1∶100），选择以下方法的一种进行发光底物处理： a. 单张杂交膜处理：将膜置于一保鲜袋中或两张醋酸纸之间，用镊子轻轻抬起一角，用一消毒的吸管从膜顶端加入0.5ml(0.5ml/100cm2)化学发光底物，让底物溶液均匀扩散到膜的表面，然后将膜放平，用一张湿润的滤纸轻轻排除气泡使膜四周被液体封闭，室温下放置5min.，然后接步骤9。 b. 成批膜处理：取一个干净的盘子，用消毒吸管取5～10ml底物溶液于盘中，用一钝头镊子将膜置于其中，轻轻倾斜盘子直到膜表面全部浸有底物溶液，室温下放置5min.，用镊子小心夹住膜的一角，提起使多余液体滴出（切勿使膜干燥），然后将其置于一干净保鲜袋中。重复以上过程将膜一张一张全部处理完后接步骤9。 9．当膜半干燥时，即刻将膜封闭在保鲜袋中。为了缩短曝光时间，膜需在室温下稳定7～8小时或37℃下15min.，达到稳定态的膜单拷贝基因的检测也只需曝光15min.，如果封膜后马上曝光处理，则曝光时间要60min.。 方法二、NBT-BCIP荧光检测 试剂：Anti-Dig-AP NBT BCIP 其它同化学发光检测。 试验程序： 1．杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。 2．将化学发光底物置于室温下。 3．用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.（封闭过程在摇床上轻轻摇动），在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。 4．在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000)，6μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。 5．在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。如果是在保鲜袋中处理，要排除气泡；如果在盘子中进行处理，要轻轻摇动，使膜全部浸入抗体溶液中。 6．去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.以除去非结合抗体。 7．与此同时，准备颜色底物溶液，在10ml检测缓冲液中混合45μl NBT和35μl BCIP，注意避免直接暴露在光下。 8．去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。 9．除去检测缓冲液，加入大约10ml颜色底物溶液，显色反应可以在保鲜袋中进行，也可以在暗盒中进行，显色反应中切勿摇动。在显色反应中，可以短时暴露于光下观察，一般几分钟后开始显色，但完全反应大约需要12小时。 10．显色完成后，用H2O洗膜以终止反应，如果膜还要再用则用TE终止反应。 结果记录可采用影印和照相的方法，膜如果贮存在TE中可长期保存颜色不变。 |
2楼2006-03-24 14:36:37
3楼2006-03-25 20:34:43
zct2008
至尊木虫 (著名写手)
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4楼2006-03-25 20:58:15
shengdeqiao
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9楼2006-12-09 05:37:52
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