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20807011

金虫 (小有名气)

[交流] 求助多糖的测定方法

亲爱的虫友们，谁有多糖的测定方法啊，国标最好，或者比较公认的方法也可以，我查过几篇文献，文献中方法虽然相差不大，但是试剂加入量没有一个共同标准，望各位虫友们帮一下忙，谢谢！
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笨笨小牛
1楼 2010-05-31 09:13:51
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郭继波

荣誉版主 (文学泰斗)

神龍教梦家园的小百姓-波波

优秀版主优秀版主
20807011(金币+5, 博学EPI+1): 2010-06-01 09:58:19
粗多糖的测定方法
2005-09-13 23:14:00

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  1. 原理
分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。
2. 适用范围
参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。
3.仪器
（1） 分光光度计
（2） 离心机
（3） 旋转混匀器
（4） 恒温水浴锅
4.试剂
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1） 80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。
（2） 2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L，加入固体无水硫酸钠至饱和。
（3） 铜贮存液：称取3.0 g CuSO4 ·5H2O，30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存2周。
（4） 铜应用溶液：取铜贮存液50 ml，加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。
（5） 洗涤液：取水50 ml，加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混匀。
（6） 1.8 mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。
（7） 20 g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。
（8） 葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0 mg/ml。
（9） 葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。
5. 操作方法
5.1 样品处理
（1） 样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml （V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。
（2） 沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml （V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。
（3） 沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml （V3），混匀后过滤，弃初始滤液后，取滤液2.0ml （V4），加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。
（4） 测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL（V5）。准确吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，沸水浴煮沸2分钟，冷却比色。从标准曲线上查得相应含量，计算粗多糖含量。
5.2 标准曲线制备：
精密吸取葡聚糖标准应用液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml（分别相当于葡聚糖0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg），补充水至2.0mL，加入苯酚溶液1.0ml，浓硫酸10ml，混匀，沸水浴2分钟，混匀，沸水浴2分钟，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度值（A），以葡聚糖浓度为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线。
6.计算
从标准曲线上查得样品相应含量，计算粗多糖含量。


               c×V5×V3×V1×0.1               c×250
葡聚糖（%）=  ----------------------     =    ------------     ……………
                  V6×V4×V2×m                    m               (1)


公式中：c--从标准曲线上查得样品测定管中葡聚糖含量，mg；
V1--样品提取时定容体积，ml；
V2--沉淀高分子物质取液量，ml；
V3 --沉淀葡聚糖时定容量，ml；
V4 --沉淀葡聚糖时取液量，ml；
V5 --测定葡聚糖时定容体积，ml；
V6 --样品比色管中取样液体积，ml；
m--样品称量质量，g；
0.1--将mg/g 换算成g/100g 的系数。
7.注意事项
（1） 苯酚-H2SO4溶液可以和多种糖类进行显色反应，常用于总糖的测定。所以测定过程中应注意容器及试剂中其他糖类的干扰。
（2） 苯酚-H2SO4溶液和不同类的糖反应，显色的强度略有不同，反映在标准曲线的斜率不同。如果已知样品中糖的结构，应尽量以同类糖的纯品做标准品，或以含有已知浓度的同类产品做对照品进行检测分析；如果样品中糖的类型未知或结构多样，则只能以葡萄糖计或其他糖计报告结果。
（3） 试验证明葡萄糖、果糖等单糖，蔗糖、乳糖等双糖、低聚糖--棉子糖，淀粉、糊精等多糖及甜味剂糖精不干扰粗多糖测定。
（4） 本方法由北京市卫生防疫站建立，经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所验证
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菩提本无树，明镜亦非台。
2楼2010-05-31 09:29:15
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郭继波

荣誉版主 (文学泰斗)

神龍教梦家园的小百姓-波波

优秀版主优秀版主
方法名称： 乌灵胶囊—多糖的测定—分光光度法
应用范围： 本方法采用分光光度法测定乌灵胶囊中多糖（以葡萄糖计算）的含量。

本方法适用于中成药乌灵胶囊。

方法原理： 供试品经0.1%十二烷基磺酸钠溶液加热回流，提取液用乙醇沉淀后，离心，将水溶液制成供试液，与苯酚及硫酸反应后置于分光光度计，于波长490nm处测定吸收度，按无水葡萄糖计算其含量。

试剂： 1. 乙醇

2. 苯酚

3. 0.1%十二烷基磺酸钠溶液

仪器设备： 可见分光光度计

试样制备： 1. 对照品溶液的制备

精密称取无水葡萄糖对照品，加水制成每1mL含无水葡萄糖0.1mg的溶液。

2. 供试品溶液的制备

取装量差异项下的本品内容物，研细，取1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入0.1%十二烷基磺酸钠溶液30mL，精密称定，加热回流2小时，立即冷却，再称定重量，以水补足减失的重量，摇匀，立即离心（每分钟3500转），精密量取上清液10 mL，加乙醇30 mL ，摇匀，冷藏24小时，离心，弃去上清液，沉淀用少量乙醇洗涤，弃去洗涤液，加水适量使溶解，转移至100mL量瓶中，加水至刻度，混匀，作为供试品溶液。

注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

注：“水分测定”用烘干法。取供试品2-5g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，疏松样品不超过10mm，精密称定，打开瓶盖在100-105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含有水分的百分数。

操作步骤： 1. 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置试管中，加水至2 mL，再加6%苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加入硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，立即冷却，以相应试剂为空白，在490nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.供试品的测定

精密量取上述供试品溶液5mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取2mL, 置试管中，照标准曲线的制定项下的方法，自“加6%苯酚溶液1mL”起，依法测定吸收度。

参考文献： 中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年版，一部，p.397。
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菩提本无树，明镜亦非台。
3楼2010-05-31 09:30:55
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游凤-shelly

金虫 (初入文坛)
还有蒽酮硫酸法
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4楼2012-05-06 20:35:28
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