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方法
菌株和质粒
黑曲霉AB4.1 (van Hartingsveldt et al.,1987)是来源于黑曲霉N402的pyrG突变株。黑曲霉D15是菌株AB1.13的蛋白酶缺陷菌株(Mattern et al., 1992)，D15能有效降低培养基的酸化(P. Punt, unpublished observation)。ile19突变株由David Gems（(John Innes Centre,Norwich, UK)）友情提供。编码GFP突变体S65T (Chiu et al., 1996; Haas et al., 1996)的sgfp基因被用在所有的构建中。质粒pMCB30(Fernandez-Abalos et al., 1998)和pBluescript-sGFP-TyG-nos-hs(Sheen
et al., 1995)均含有sgfp基因。质粒pIGF含有黑曲霉glaA启动子和截短的glaA基因（相当于499个氨基酸，G499）和glaA终止区域(Archer et al., 1994)。质粒pAN56-2含有glaA启动子和截短的glaA基因（相当于514个氨基酸，G514）和黑曲霉trpC终止区域(EMBLZ-32690)。含有黑曲霉pyrG基因(van Hartingsveldt et al., 1987)的质粒pAB4.1和含有细菌潮霉素抗性(Punt et al., 1987; Punt & van den Hondel, 1992)的质粒pAN7.1被用作筛选转化菌株。
生长和培养条件
含sGFP、GLA514融合蛋白质的黑曲霉在BenneH}Lasure培养基上培养，而含GLA499融合蛋白的菌株在Vogel的培养基上生长(Vogel, 1956)（经修改用10g蔗糖取代麦芽糖糊精或葡萄糖），如果需要用1.5%琼脂固化。为了镜检，含有融合蛋白质的菌株的孢子粘合在盖玻片上，在Petri碟中并在一层薄的培养基上生长(Harris et al., 1994)。一种经过修改的soya milk 培养基也被应用(MacKenzie et al., 1994)。pyrG突变株的培养基中含有10mM尿苷。无性孢子的孵育在PDA培养基上进行，培养5-6天后用0.1%吐温20收获并用水冲洗2次。所有的培养物在30度培养，如有需要可250转/分搅拌培养。
构建基因融合和转化子
质粒抽提、酶切、DNA连接和大肠杆菌转化参见Sambrook描述（Sambrook et al. (1989)）。图一显示不同的构建。为了构建GLA499: : sGFP编码区，以pMCB30为模板PCR扩增全长的742bp sgfp基因。引物为(1) 5«-CGATATCTAGAATGGTGGCAAGGGCGAGGA, (2) 5«-TGACTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA。sgfp片段经酶切并连入pIGF上位于glaA基因和glaA终止区域中的XbaI克隆位点。GLA514: : sGFP编码基因是通过从pBluescript-sGFP-TyG-nos-hs(Sheen et al., 1995)克隆sgfp并在两端加上NcoI（平端）和BamHI位点，而形成载体pAN56-2sGFP。为了构建GLA514: : sGFP-HDEL融合基因，以pBluescript-sGFP-TyG-nos-hs(Sheen et al., 1995)为模板。引物为(1)在pBluescript反式引物5«-GGAAACAGCTATGACCATG, and (2) sGFP-HDEL反式引物 5«-CGGGATCCTTACAG CTCGTCGTGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC.882bp的sGFP-HDEL片段通过NcoI和BamHI酶切并克隆到pAN56-2而产生pAN56-2 (sGFP-HDEL)。所有的构建都通过测序验证。细胞质蛋白sGFP按照Siedenberg的描述构建（Siedenberg et al. (1999)）。
对于转化实验，黑曲霉在Vogel培养基（对于AB4.1菌株额外补充10mM的尿苷）上培养18-20小时。原生质体通过加20mg的Novozyme 234 (Novo Nordisk) (g wet wt mycelia)-1制的，利用聚乙二醇(Punt&van den Hondel, 1992)把含有sgfp质粒pAB4.1和pAN7.1分别转化到AB4.1和N402菌株。转化子经过纯化，sgfp的存在通过Southern杂交(Southern, 1975)和菌落PCR验证(van Zeijl et al., 1998)。 |
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