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细胞培养技术
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 一、设施：1实验室房间. 2.超净工作台. 3冰箱：4℃冰箱和低温冰箱。 4显微镜（倒置显微镜＋摄像系统）。 5二氧化碳孵箱。 6离心机。 7恒温水浴箱。 8深低温保存设备：层析降温仪，液氮装置。 9抽滤装置和水纯化装置。 10角膜内皮分析仪。 11计算机。 二、组织培养和保存： (一)、组织培养的基本概念： 把体内的细胞、组织和器官放在类似体内的体外环境中，可使其存活、生长、繁殖或传代。借以观察研究其生长发育、细胞形态和功能，从血分机研究某些疾病的发病机制。严格地说来，组织培养又可分细胞培养、组织培养和器官培养。 1．细胞培养(cell culture) 是将机体内的组织取出分散(机械或酶消化)成为单个细胞，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制(contactimhibition)以及细胞衰老过程等生命现象。在细胞培养中，细胞不再形成组织。 2．组织培养(tissue culture) 指组织在体外条件下维持生长，组织仍可分化并维持其结构和／或功能。需要说明的是，进行组织培养时，不论采用什么方法和条件，被培养组织的主要成分仍然是细胞；细胞在生长过程中总有移动和其他变化，这将使得培养的组织难以长期维持其特有的结构和功能。培养时间越长，发牛变动的可能性就越大。结果，常使单一类型的细胞保存下来，最终也成了细胞培养。另外，所谓细胞并不意味着细胞彼此是独立的，细胞之间仍然相互依存，呈现一定组织的特性。所以，组织培养和细胞培养并无严格区别，两者在一定程度上可看作是同义语。 3．器官培养(organ culture) 指器官为原基、整个器官或器官的一部分，在体外条件下维持生长或分化并保持结构和／或功能。 原代培养或初代培养(Primary culture)，即从体内取出细胞或组织的第一次培养。传代(passage)或再培养(reculture)，即把一瓶培养细胞全部或分成几份接种人另一些培养器皿中。原代培养经首次传代成功后即为细胞系(celllinne)。具有无限繁殖能力和能反复进行传代的细胞系，即为连续或无限细胞系(continuous cell line)，又称为已建细胞系(estabilshed cell line)。体外(in vitro)培养是在体外进行的生物过程的实验，现在常与组织培养一词通用，与体内(in vivo)相对。 （二）、组织培养的基本条件： 在体外培养细胞必须能够维持和模拟细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程，为此必须提供必需的营养、适宜的pH、严格的无菌条件、渗透压、培养器皿、温度和二氧化碳等条件。 1培养基： 目前广泛使用的培养基是化学合成培养基：其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质； （1）．氨基酸(amino acid) 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。所有细胞都需要酪氨酸、组氨酸、赖氢酸、精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等12种氨基酸。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺。谷氨酰胺具有特殊的作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。 （2）．维生素(vitamins) 是维持细胞生长的一种生物活性物质，它在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。其中脂溶性维生素(A、D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。维生素C也是不可缺少的，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。 （3）．无机离子(ion) 细胞的生长，除了需要钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素以及碳酸氢盐和磷酸氢盐等以外，还需要铁、铜、锌等微量元素。这对调节细胞渗透压、某些酶的活性以及溶液的酸碱度都是必须的。（4）．碳水化合物(carbohydrate) 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。（5）．激素和生长因子(hormone and growth factor) 。（6）．其他成分 在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A。 2、气体和pH值： 气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。 一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中培养。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7．2。7．4c在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，PH值发生变化。为了维持培养液pH值的恒定，通常加入NaHC03来调节。由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。 3、培养瓶和培养皿： 培养细胞的性质不同，所采用的培养器皿也不向。单层培养可采用塑料或玻璃瓶。半固体培养可采用胶原或琼脂等凝胶，通常使用长方型的玻璃培养瓶，其优点是可以清洗、消毒和反复使用，但仍有被污染的可能性c国外已普遍采用系列化塑料制品，一次性使用后即弃去。其优点是方便、可靠，但成本较高，国内尚不能普遍应用。 4、温度： 培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35C—37C。偏离这一温度，细胞正常的代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。总的来说，培养细胞对低温的耐力比高温高。温度不超过39C时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞培养置于39C—40C环境中1h，即受到一定损伤，但仍能恢复；当温度达43C以上时，许多细胞将死亡。 当温度下降到30Y—20C时，细胞代谢降低，因而与培养基之间物质交换减少。 首先看到的是细胞形态学的改变以及细胞从基质上脱落下来。当培养物恢复到初始的培 养温度时，它们原有的形态和代谢也随之恢复到原有水平。 （三）、组织细胞的保存： 为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(－70℃—－196C)的特点。 细胞深低温保存的基本原理是：在－79C以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0C-20C阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。用电镜观察，可见细胞的核膜上有大量针尖样小孔。牛化研究发现，在此温度范围内，钾离子和钠离子集聚在细胞两侧，具有细胞毒性。因此，为了避免0C——20C冰晶的形成和细胞膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。目前常用的保护剂有甘油和二甲基亚矾(DM50)，它们可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在-130C以下低温中能减少冰晶形成，DMSO和甘油对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围为5％—15％，一般常用10％o 为了保持细胞最高的存活率，一般采用慢冻快融的策略。标准冷冻速度以13℃／分的速度下降，当温度达—30C时，下降速率可增至15C—30C／分，到达-100C时则可迅速浸入—1％℃的液氮中。要适当掌握下降速度，过快将减少细胞水分透出，太慢则易促进冰晶形成。 复苏细胞时，可将细胞取出后立即投入37C-40C水溶化冻融，迅速通过细胞最易受损的-50℃。此时细胞仍能生长，活力不受任何影响。 （四）、组织培养的应用： 传代细胞系可用来研究细胞的功能，如分泌的产物或与其他类型细胞的交互作用。然而，应该注意到体外的培养状态不同于活体的细胞环境c所以，在体外观察到的功能有时仅反映了该细胞类型的内在能力，而不是其在正常体内的能力； 当怀疑某种疾病是代谢因素引起时，可用来自相关组织的细胞进行培养，以鉴别细胞在生理学上的内在缺陷。还可研究与活体病理因素相近的某些环境或因素对正常细胞功能的影响。这些因素包括在正常活体内自然发生的动态改变，如激素水平的变化。另外，组织培养还用以测定外源性物质的毒性。 细胞培养在病毒感染的诊断和研究方面起着重要的作用。大量细胞培养可产生制造疫苗所需的病毒抗原和干扰素等。角膜细胞已用于单疤病毒感染机制的研究。角膜上皮和内皮的培养细胞移植是目前正在研究的课题。 （五）、培养和保存用液： 1．平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS) 主要由无机盐和葡萄糖组成。无机盐离子不仅是细胞生命所需成分，而且在维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度方面也起着重要的作用。少量的酚红溶液作酸碱度变化的指示剂，溶液变酸时呈黄色；变碱时呈紫红色；中性时呈桃红色。借此很容易观察到培养液pH的变化。 Hsnks液和Earle液可作为较为完善的溶液的代表。它们之间的主要区别是缓冲系统不同。Hanks液缓冲能力较弱，在普通空气条件下可达到平衡；Earle液含高浓度的NaHC03，缓冲能力较强，需用5％的二氧化碳平衡，办即在二氧化碳孵箱中才能达到平衡。大多数培养基以Earle液做为基础液。 由Dulbecco和Vogt制成的磷酸缓冲液(phosphate balanced solution PBS)，尤其是除去钙和镁的溶液，称为PBS(-)，常用于细胞的洗涤以及作为胰蛋白酶和EDTA的溶剂。它不含NaHCO3，便于高压灭菌。此外，它还用于制备L—谷氨酰胺及抗菌素等培养液的附加溶液。 2．合成培养基 合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，它有一定的配方，是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种，有的培养基仍在不断进行改良。对于培养基的选择，则要根据条件和习惯，难以强求“律。到目前为止，国外所选用的用于角膜保存的培养基多为TC-199和低限量基础培养基(mimi-mum essential medium, MEM)。 3．保存液的添加成分： (1)葡聚糖(dextran)：又名右旋糖酐。Sachs(1957)首次将葡聚糖加入眼球保存液来防止角膜基质层发生过度水肿。以后，McCarey和Kaufman(1974)证实角膜在添加葡聚糖的保存液中可维持功能和超微结构的完整。但使用该保存液保存4天后，角膜平均厚度从0.65mm增加到0．75mm，从而妨碍了常规的内皮显微镜检查。 (2)PH调整剂：早期，国外商业化的短期保存液，PH值很稳定。这并不奇怪，因为在组织保存液中含有一定量的碳酸氢钠。但这种稳定需要用二氧化碳气体来平衡。使用密封的保存瓶则很难维持恒定的PH值。所以，在组织培养系统中加入合成的pH稳定剂非常重要。在角膜长期灌洗实验中发现，经乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydrox-yethylpiperazine-N-ethane-sulphonic acid,HEPES)具有很好的稳定pH的性能。目前，将按15—20mM／L加入保存液，可使PH值稳定在7．3。在HEPES存在的情况下，不必强调使用PH指示剂。 (3)2—琉基乙醇(2—mercaptoethanol，2—ME)：2—ME对细胞的生长具有重要作用。有人认为它相当于胎牛血清的可透析组分，可直接刺激细胞生长。其活性部分是硫氢基，能使血清中含硫的化合物还原成谷肮甘肽，诱导细胞增殖，这是一种非特异的激活作用，并能同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进对分裂原的反应和DNA合成。常配制成0．1mol/l的贮存液，使用时每升培养液加0．5ml。 (4)抗生素：尸眼的表面极易污染，随着时间的延长，细菌繁殖迅速增加。故应采取必要的措施来保持组织的无菌性。用力冲洗可机械性地去除大多数微生物。保存液本身也应提供一个无菌的环境。青霉素在高浓度时具有广语的杀菌作用，但维持时间比较短。对供体眼细菌污染情况的研究结果表明：庆大霉素和多粘菌素(polymyxin)在对抗致病菌(绿脓杆菌和葡萄球菌)方面最为有效。在短期保存液中，庆大霉素(100微克、mL)可去除85％的供眼污染。因为存在有耐庆大霉素菌株，而多粘菌素对它们有100％的对抗作用，所以两者合用效果可能较佳。 (5)血清：血清是一般培养基所必需含有的成分。血清的作用是：①营养：血清中含有各种生长因子，可刺激细胞生长。②解毒：包括抑制抗菌素的毒性。血清中含有结合毒性物质的因子，可解除脂肪酸、重金属和蛋白质的毒性。③中和胰蛋白酶的活性。④提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。⑤提供一些酶、维生素、微量元素和激素等。 对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要是：第一、血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难；第二，血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；第三，不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。血清又可能成为病毒和支原体污染的来源之一。因此，寻找血清替代物已成为培养工作的一项任务。但目前更多地还是使用无血清培养基培养细胞。 |
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