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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蓝白斑筛选什么也不长
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plantaqp

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by xiaoru2010 at 2010-05-14 07:28:15:

谢谢，请问一般连接多长时间呢？

时间长短有的说明书 说几分钟就够了，但是从来没试过这么短时间的，我一般有的过夜有时候1个到几个小时，看自己时间的，有时间就让他多练一会。 我如果连接时间比较短，我一般是取一半来转化，另一半过夜连。根据我的经验问题一般不是出在这里。
   我觉得目的片段的质和量很重要，目的片段多多益善，而不是所谓的3：1. 当然目的片段质量要高，我都是胶回收。因为如果目的片段不纯比如含有影响酶活性的东西（试剂盒质量很关键，PCR产物直接连接的话，PCR体系中成分可能有干扰），连接必然受影响。
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11楼2010-05-14 14:38:56
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by plantaqp at 2010-05-14 14:38:56:


时间长短有的说明书 说几分钟就够了，但是从来没试过这么短时间的，我一般有的过夜有时候1个到几个小时，看自己时间的，有时间就让他多练一会。 我如果连接时间比较短，我一般是取一半来转化，另一半过夜连。 ...

受益匪浅呀！多谢仁兄！确实没有回收好，惭愧惭愧
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12楼2010-05-14 15:39:05
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
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不长斑是结果，可是导致这个结果的可能性太多了。连接转化做没做好，感受态效率是否高，培养基是否合适，抗生素是不是加多了·······每一步出问题了都会不长菌的。
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13楼2010-05-14 16:23:58
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick
★
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确定一下抗生素是否加错了，再就是浓度是否正确。
其次，检查一下感受态细胞，最好从比较有名气的公司订购，或者以其公司的菌种自己制作感受态，我一直都是自己做感受态DH5a,转化效率也是蛮高的。注意做好后要先进行验证，阴性、阳性对照，计算一下转化效率等。
如果都没有问题，可能就是连接出现问题了，应该逐项仔细检查。我也有连接转化一个不长的时候，很郁闷。连接转化时也出现阳性对照长得很好，但是我的样品要么不长，要么长得很慢，与阳性不同步。呵呵，不过能找到你想要的就可以了~~

祝顺利噢~~~
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我们都是芸芸众生的小人物，相遇相知，都是幸福！
14楼2010-05-14 16:32:53
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
可能原因：1、感受态制备效果不好；
               2、要是转化用的是新连接产物（质粒），有可能连接效果很差；
               3、抗生素种类和浓度（按理说不会有这样低级错误发生吧！）。
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大家共同交流、共同提高！！！
15楼2010-05-16 12:38:11
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小白兄

金虫 (小有名气)
感受态你们是买公司的？还是自己做啊？我们实验室是自己做的电转感受态
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时光如流水，匆匆而过。
16楼2010-05-16 12:44:07
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.感受态细胞的问题  2.做链接转化时步骤出现问题
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17楼2010-05-16 13:49:01
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