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质粒抽提原理
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碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当 浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡 萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不 会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言， 几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活 性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞 中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工 ，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质 粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告 诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一 定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很 多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解 ，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导 致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试 一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性， 以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁 要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一 步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件 下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组 DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。 每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。 最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中 加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关 系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐 析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉 淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的 。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的 量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇 到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是 钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家 知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产 生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一 起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给 共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中 和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只 要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而 且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以 观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就 被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶 解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉 淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分 一点。 不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀， 因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不 然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多 道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应 该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液 （比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入 氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有 很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应 （比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚 去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀 时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是 为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后 离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的 沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大 量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀， 就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得 到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大 量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到 三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样 品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性 质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别 是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心 在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了 不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。这里暂不深究。 想说的，终于说完了。谢谢你的耐心。 |
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